[摘要]目的：探讨多西紫杉醇对宫颈癌细胞低氧诱导因子-1α基因表达的影响。方法：Hela细胞在正常条件下(氧气浓度20％)培养后，对照组在正常条件下继续培养24小时，试验组转入缺氧条件下培养24小时，氧气浓度分别为1％。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测HIF-1αmRNA表达变化，蛋白质免疫印迹法测定HIF-1α蛋白水平表达变化，MTT法检测肿瘤细胞抑制率。结果：多西紫杉醇可抑制宫颈癌细胞生长，正常对照组有一定水平的HIF-1αmRNA表达，但几乎检测不到HIF-1α蛋白表达，低氧条件下HIF-1αmRNA表达维持在高水平，但HIF-1α蛋白则明显升高(t=2.471-5.474，P＜0.01)；加入5×10-6mmoI/L和20×10―6mmol/L的多西紫杉醇后则可明显抑制HIF-1α蛋白和mRNA在低氧下的增高，而对常氧下的HIF-1α基因表达无影响。结论：多西紫杉醇可抑制官颈癌细胞生长，且可抑制HIF-1α基因的低氧性活化。
[关键词]低氧诱导因；宫颈癌；多西紫杉醇
文章编号：1009-5519(2008)08-1109-03 中图分类号：R73 文献标识码：A
宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤中肿瘤细胞无法调控地增殖是其最主要特点，而不断增多的细胞数导致细胞耗氧量不断增加，造成肿瘤处于缺氧状态。缺氧又能通过一个关键的转录因子――低氧诱导因子(hypoma in-ducible factor.HIF-1)使肿瘤的血管生成、转移、耐药等恶性行为更加明显。多西紫杉醇是一种新型的半合成的紫杉醇衍生物，作用于细胞骨架的微管系统，促进细胞微管聚合。研究发现。多西紫杉醇有广泛的抗肿瘤活性。在肺癌、卵巢癌和头颈癌等有良好的临床疗效，晚期宫颈癌也有一定的效果，化疗药物的最终效应是诱导肿瘤细胞凋亡，所以研究多西紫杉醇在宫颈癌细胞对HIF-1α低氧性活化的影响可为临床治疗提供基础和理论依据。
1 材料和方法
1．1 细胞及培养条件：人宫颈癌细胞系Hela由上海生命科学院细胞库购买，培养于37℃、5％CO2含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中。
1．2 药物和试剂：多西紫杉醇购自日本中外制药株式会社。噻唑蓝(MTn购于华美生物有限公司。
1．3 MTT法：将2×106/ml细胞接种于96孔板，每孔200μl，贴壁生长后加0.1-50×106mmol/L浓度多西紫杉醇处理，每种浓度平行3孔，设立空白对照，实验重复3次。各实验组分别在加药后12、24、48和72h后弃上清后，每孔加入200μl新配制的5g/L浓度的MTT，继续孵育4h，弃上清加入150μl的二甲基亚砜(DM-SO)，混匀后置于DG3022型酶标仪，在490nm波长测定吸光度(A)。肿瘤细胞抑制率=(1-实验组测定值／对照组测定值)×100％。
1．4 干预措施：Hela细胞在正常条件下进行细胞培养，细胞培养贴壁率在70％～80％后，根据分组，将实验组细胞移人细胞缺氧培养箱培养48h，培养基加或不加10×106mmol/L多西紫杉醇，每组6只培养瓶。正常对照组继续在正常条件下培养24h。
1．5 HIF-1α基因表达检测：HIF-lamRNA RT-PCR法分析：Trizol法分别提取各组细胞的总RNA，逆转录反应体系(20μl)组成：焦碳酸二乙酯(DEPC)水7μl，5×Buffer 4μl，脱氧核苷三磷酸(dNrPs)(10nmol/L)2μl，寡糖(Ousgo)(dT)16μl，核糖核酸酶(RNase)抑制剂1μl，总RNA 4μl，逆转录酶1μl，37℃5min，42℃ 1h，70℃：10min灭活逆转录酶。PCR引物序列如下：HIF-1α上游5-CCTGCACTCAATCAA一3，下游5’-TCCTGCTCT-GTITG-3(618 bp)；β-acfin上游5-CATCCTGCGTCTGACCT-3，下游5一TCAGGAG2GAGCAAGGATCTFG-3(480 bp)。95℃变性5min→95℃75s，50℃60s，72℃60s(35个循环)→72℃10min，扩增产物在10g/lr琼脂糖凝胶上进行电泳，GelDoe2000凝胶图像分析系统扫描分析条带积分光密度，用相对灰度值(目的片段光密度/β-actin光密度)代表各产物的相对含量。HIF-1α蛋白免疫印迹分析：粗提Heh细胞总蛋白，用LoWv法测蛋白含量。凝胶总长10.5cm，其中浓缩胶(40g/L)1.5cm，分离胶(130g/L)9cm，尿素终浓度为8mol/L。取40μg细胞总蛋白与上样缓冲液混合至终体积为20μl沸水浴7分钟，冰浴冷却，加2μl β-巯基乙醇混匀，4℃10000r/min离心10分钟后上样。浓缩胶电泳电压为80V、分离胶为135V，电泳4h后,考马斯亮蓝染色，蛋白质湿式转印：120mA、4℃转印10h。将PVDF膜置于含10ml/L牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(PBS)中振摇2h，4℃过夜，依次用HIF-1α多克隆抗体混合液(1/500)、碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG(1:500)反应，常规DAB显色，记录，测条带光密度。
1．6 统计分析：所有统计学处理均在SPSS 10.0软件包中进行，各组数值以均值土标准差表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较用单因素方差分析或多因素方差分析，两两比较采用LSD法。
2 结果
2．1 多西紫杉醇对Hela细胞的生长抑制作用：0.1～50×10-6mmol/L多西紫杉醇分别孵育12、24、48和72h后，对Hela细胞的生长抑制作用结果。见表1。细胞抑制率与药物浓度及作用时间相关，多因素方差分析结果表明不同药物浓度处理组间细胞抑制率差异有显著性(F=2131.661，P=0.000)，不同作用时间处理组间也差异有显著性(F=1395.945，P=0.000)。除0.1×10-6mmol/L多西紫杉醇组，各实验组随作用时间延长，细胞抑制作用越明显，但48h后药物的细胞毒性无明显增强，不同作用时间组间细胞抑制率差异有显著性(P＜0.05)。不同药物浓度处理组中除0.1×10-6mmol/L，0.5×10-6mmol/L组和10×10-6mmoFL，20×10-6mmol/L，50×10-6mmol/L多西紫杉醇处理组外，其他浓度处理组间两两比较差异均有显著性(P＜0.05)。因此随后的多西紫杉醇 处理为10×10-6mmol/L.24h。
2．2 多西紫杉醇对HIF-1α基因表达的影响：(1)Hela细胞HIF-IamRNA水平变化：正常对照组有一定水平的HIF-lctmRNA表达，实验组Hela细胞HIF-IamRNA在低氧和不同浓度多西紫杉醇处理时水平无明显变化。1％氧气浓度组加人多西紫杉醇后HIF-lamRNA水平明显下降(t=3.567，P＜0.01)。见图1，表2。(2)Hela细胞HIF-1α蛋白表达变化：正常对照组无HIF-1α蛋白表达， 1％低氧处理后HIF-1α蛋白含量显著升高(t=2.471～5.368，P＜0.01)，但在低氧的同时加入不同浓度的多西紫杉醇处理24h后HIF-1α蛋白含量显著降低(t=4.284，P＜0.01)。结果见图2，表2。
HIF-1是一个异源二聚体转录因子，由α和β两个亚单位组成，两个亚单位的氨基端均含有碱性螺旋－环－螺旋和Per/Arnt/Sim结构。HIF-1α为HIF-1中受氧调节的特异性结构，HIF-1β是芳香烃受体核转运蛋白，其结构与HIFl的核内稳定性及构象转变有关。HIF-1广泛参与哺乳动物细胞缺氧诱导产生的转录活化，通过与缺氧反应元件的结合来激活靶基因的转录。其介导转录的基因涉及能量代谢、血管新生、铁与血红蛋白的代谢以及一些细胞因子和一氧化氮的合成，这些过程在肿瘤细胞发生发展中表现得尤为活跃，HIF-1α在肿瘤发生中的作用值得探讨。多西紫杉醇是新近研制应用的一种紫杉醇类抗肿瘤药物，主要作用于细胞的微管系统，促进微管聚合并稳定微管结构。阻止其解聚成亚单位，影响细胞的正常有丝分裂过程，与泰素无完全交叉耐药。在胞内浓度高且滞留时间长。体内外实验研究表明，多西紫杉醇对多种人肿瘤细胞系：结肠癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌等都有细胞毒性，并能诱导肿瘤细胞凋亡，诱导凋亡与肿瘤细胞的严状态、bcl-2磷酸化、bax增高有关。
本实验结果提示：Hela细胞在缺氧培养条件下，HIF-lαetm-RNA水平无明显变化，但其蛋白表达急剧升高，正常Hela细胞在常氧下即有一定水平的HIF-lctmRNA表达。但几乎检测不到其蛋白表达，细胞缺氧培养后，HIF-lamRNA水平最高升高4.6倍、蛋白表达升高6.9倍，分析原因可能是在缺氧培养条件下，培养液中的成分有所改变，使细胞的信号分子发生改变，HIF-lotmRNA的上游信号启动。HIF-1α在肿瘤组织中的表达是增高的，这与肿瘤的结构和分子生物学特征改变有关系，肿瘤内氧浓度的减少产生了生理性的刺激，使HIF-lamRNA的合成增加；肿瘤特征的一些基因通过某些途径，如活化一些癌基因、灭活肿瘤抑制基因，达到增加HIF-1α的转录或表达活性间，而且有研究证实，此现象为肿瘤细胞特有，与正常细胞相区别的是，此功能不依赖于氧浓度，这是本研究中正常组Hela细胞有一定程度的HIF-la表达的重要原因。本实验表明。多西紫杉醇对宫颈癌细胞系Hela有同样作用，1×10-4mmol/L以上浓度多西紫杉醇作用24h有较明显的生长抑制作用，10x10-6mmol/L多西紫杉醇作用48h时生长抑制率可达到76.08％。结果表明，在10×10-6mmol/L浓度及作用48h内，多西紫杉醇对宫颈癌系Hels的治疗有一定的剂量和时间依赖性。此后。随药物浓度增多和预处理时间延长其疗效无明显增强。并且，在低剂量区多西紫杉醇还表现出一定的耐药性。在加入不同浓度的多西紫杉醇后，均明显的抑制HIF-lamRNA和蛋白在低氧条件下的表达。
总之，本实验结果显示，多西紫杉醇对宫颈癌细胞系Hela体外有较好的细胞毒性和HIF-1α基因表达抑制作用。为临床宫颈癌的治疗提供了新途径和方法。但多西紫杉醇对宫颈癌细胞HIF-1α基因表达抑制作用的具体机制还有赖于进一步研究。