【摘要】目的：评价G6PD试剂盒在Roche modulor 010自动化分析仪的应用情况。方法：通过重复测定检测系统的精密度，按EP6-A文件稀释并检测线性，同时检测质控物评价其稳定性。另外，检测疑似HbH病人的G6PD活性。结果：MHb-RT高值和低值标本批内、批间CV分别是4%、3%和2%、8%；G6PD/6PGD比值的决定系数R2分别为0.999；质控物CV值为2%。3例疑似HbH病人标本检测结果正常。结论：此试剂盒的精密度和线性较好，能够满足临床常规检验需要。
【关键词】G6PD；精密度；线性关系；Roche modulor 010自动化分析仪
文章编号：1009-5519（2008）16-2387-03 中图分类号：R446 文献标识码：A
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏症是基因突变引起的一种X连锁不完全显性遗传性疾病。G6PD是磷酸戊糖旁路代谢中产生还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的关键酶，其缺陷可导致蚕豆病、药物性溶血、新生儿溶血、感染性溶血及非球形细胞溶血性贫血等，在世界范围内约有4亿人受累，中国主要是广东、广西、海南、云贵等地区。多年来，G6PD的检测方法在不断更新，目前主要有：四氮唑蓝纸片定性法、变性珠蛋白小体生成试验、高铁血红蛋白还原试验(MHb-RT)、荧光斑点法(FST)、G6PD活性测定，以及基因检测等[1]。其中，通过全自动生化分析仪检测G6PD活性是临床常规检验发展的趋势。本文在Roche modulor 010自动化分析仪上对米基公司G6PD检测试剂盒的精密度和线性等进行初步评价。
1 材料与方法
1.1 试剂：G6PD测定试剂及配套质控物由广州市米基医疗器械有限公司提供，批号GS070720-08。
1.2 方法
1.2.1 原理：人红细胞(RBC)戊糖代谢的关键酶G6PD催化G6P(6-磷酸葡萄糖)转化成6PG(6-磷酸葡萄糖酸)时，伴有将NADP(氧化型辅酶II)转化为NADPH的作用。因此NADPH的量可以反映G6PD活性。但是，单独检测G6PD活性不能排除因其他原因对G6PD活性的影响，如：贫血、标本溶血、凝血、陈旧以及污染等。因为，一般RBC戊糖代谢的另一同工酶6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6-PGD)活性稳定，所以，可以同时测定6-PGD的活性将其作为内标物避免加样的误差，计算G6PD/6PGD比值来判断G6PD活性是否缺乏。
1.2.2 参数设置：实验仪器为Roche modulor 010自动化分析仪，检测方法为速率法，主要按照厂家提供的检测参数进行设置。
1.2.3 标本预处理时间的确定：取MHb-RT正常标本按说明书要求配成血红蛋白液(全血20 μl+1.2 ml蒸馏水)，分别在10、20、30和40分钟(min)时上机检测。
1.2.4 精密度测定[2]
1.2.4.1 批内精密度测定：取MHb-RT检测结果为98.5%和12.4%的高值(H)、低值(L)标本，重复20次测定，计算高值、低值标本均值(x)、标准差(S)及变异系数(CV％)。实验在30min内完成。
1.2.4.2 天间精密度测定：标本同1.2.4.1部分。将2 ml全血分装到5支试管，4 ℃保存，每2 d用1支，吸样后迅速保存于4 ℃，在Roche modulor 010上连续测定10 d。计算高值、低值标本均值(x)、标准差(S)及变异系数(CV%)。
1.2.4.3 线性测定：按EP6-A文件进行标本浓度稀释。取一个MHb-RT检测的高值标本(H)和一个低值标本(L)，按照3(H):1(L)，1(H):1(L)，1(H):3(L)，配成3个中间浓度水平，加上原先两个水平，共5个水平，每个水平测2次，取均值作线性回归分析。
1.2.5 质控物稳定性的评价：取质控品每天测试1次，连续测试10 d，分析其稳定性。
1.2.6 疑似HbH病标本的检测 对3例Hb电泳出现可疑条带，高度怀疑为HbH病的标本进行MHb-RT试验，同时进行G6PD活性测定。
1.3 统计方法：用SPSS10统计软件和Microsoft Excel进行数据分析。
2 结果
2.1 上机时间对检测结果的影响。试剂盒说明书要求试验在标本前处理后20min内上机检测。为满足实验室临床实际操作的要求，本文分析了不同上机时间对检测结果的影响，发现在标本预处理后40min内进行检测，结果不会出现明显变化，见表1。
2.2 精密度实验
2.2.1 批内精密度：分别对MHb-RT实验结果高值(H)、低值(L)标本，进行20次重复测定，结果见表2。
2.2.2 天间精密度测定：分别对MHb-RT实验结果高值(H)、低值(L)标本，连续重复测定10 d，结果见表3。
2.3 线性测定：本文按照EP6-A文件进行样品线性分析。由图1可见，6PGD活性随稀释比例变化不大，回归线近水平；但G6PD检测则出现明显的斜线线性。G6PD/6PGD比值的R2为0.999，说明线性良好。结果见表4、图1、图2。
2.4 质控物检测结果：连续10天检测厂家质控品结果见表5。
3 讨论
检测原理上，米基公司试剂盒采用双试剂法检测，从一定程度上能够减少血脂等干扰，但是，比值法的检测是在假设内标物6PGD活性正常的情况下进行的，有资料显示个别病人出现6PGD缺乏的情况[3]，所以在检测过程中需要引起重视。
按厂家提供的参数设置检测时间点16~31，实验发现，连续监测曲线的第十六点正好在2试剂加入点附近，因此我们将检测点由16~31修改为18~31。检测曲线为线型，不影响检测结果。
在精密度试验方面，单独测G6PD活性的批内精密度尚可，比值CV%都＜5。但天间CV%值较大(＞10)，低值(L)标本G6PD/6PGD比值CV%值＜10，估计与标本保存条件等有关。
质控物的性质是评价试剂盒优劣的一个重要指标。本文通过连续10d检测发现G6PD、6PGD的CV%较大，接近20％，可能与质控物在第五天后出现溶血有关；但G6PD/6PGD比值CV%却很小，为2％。说明G6PD/6PGD比值不受溶血的影响。这也就是该试剂盒采用(比值法)进行G6PD活性高低判断的优点所在。但是，由于厂家提供的质控品的使用期较短，频繁的更换质控物不利于建立westgard质控图，对检测进行长期的监控，是该试剂盒亟待解决的一个问题。
HbH病的RBC脆性减低，在蒸馏水中不能完全溶血，所以会使MHb-RT结果偏低，造成假阳性。遇到这样的标本，采用MHb-RT法就要先离心，再比色。本试验以比值法检测了3例HbH病的标本，发现该法不受RBC脆性减低的干扰。
参考文献：
[1] 叶应妩，王毓三，申子瑜，等.全国临床检验操作规程[M].第三版.南京：东南大学出版社，2006.1.
[2] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices，Approved guide-line[S]. NCCLS，Document EP5-A，1999.1.
[3] Caprari P，Caforio MP，Cianciulli P，et al.6-Phosphogluconate dehy-drogenase deficiency in an Italian family[J]. Ann Hematol，2001，80(1)：41.
收稿日期：2008-05-05