【摘要】目的:p53是迄今临床发现与肿瘤发病相关性最高的肿瘤抑制基因(TSG),是肺癌中发生频率最高的遗传改变。本研究的目的观察肺腺癌细胞中p53基因突变对状态对重组人p53腺病毒注射液治疗疗效的影响。方法:将重组腺病毒载体所携带的野生型p53 基因导入人肺腺癌耐药细胞株GLC-82及A549,通过Western blot 法分析外源野生型p53 基因在细胞内的表达, MTT 法和流式细胞术观察对细胞生长抑制及细胞周期、凋亡的影响。结果:通过Western blot 证实了外源p53 基因能在GLC-82 及A549 细胞中高效表达。MTT 法观察到Ad-p53 对肺癌细胞的抑制作用呈时间依赖性、剂量依赖性效应,流式细胞术检测结果显示, Ad-p53与能使细胞阻滞于G0～G1 期, S 期细胞比例明显减少,引起的A549 细胞凋亡率为(15.35±1.31) %, GLC-82 细胞凋亡率为(20.88±0.71) %。结论:Ad-p53能可以抑制含突变型p53 基因及含野生型p53 基因的人肺腺癌细胞株的生长,促进其凋亡,作用效应不受内源性p53 状况的影响。
【关键词】重组人p53腺病毒;肺癌;p53基因
【中图分类号】R743.2 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)09-0002-02
p53基因是重要的肿瘤抑制基因,同时肺癌中p53基因突变率较高,所以rAd-p53基因治疗肺癌的研究受到广泛的重视。但有些肺癌患者p53基因并没有发生突变,因此,我们研究应用Ad2-p53 制剂将重组腺病毒载体所携带的野生型p53 基因导入人肺腺癌细胞株GLC-82 (含突变型p53 基因) 及A549(含野生型p53 基因) 中,观察肺腺癌细胞中p53基因突变对状态对重组人p53腺病毒注射液治疗疗效的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂、仪器:人肺腺癌细胞株GLC-82 购自中科院肿瘤所分子肿瘤学国家重点实验室,A549购自上海细胞所。试剂:Ad-p53 注射液(今又生) 由深圳市赛百诺基因技术公司提供,DDP 购自山东齐鲁制药厂,一抗兔抗人p53 多克隆抗体(FL-393:sc-6243) 及羊抗兔二抗购自Santa Cruz 公司,一抗羊抗人β-actin单克隆抗体及兔抗羊二抗购自Sigma 公司, RPMI1640 购自GIBCO 公司,新生牛血清购自中美合资兰州民海生物工程有限公司,噻唑蓝(MTT) 、DMSO 购自Sigma 公司。
主要仪器: ELX800 酶标仪(美国BIO-TEK INSTRUMEN TS) 、流式细胞仪(美国BD-FACS Vantage SE) 和半干电子转膜仪(瑞典LKB)。
1.2 腺病毒滴度测定:Ad-p53 剂量为1 ×1012 VP/(mL•支) (VP :病毒颗粒,virus particle),空斑实验确定其滴度为1 ×1010 PFU/(mL•支) (PFU :空斑形成单位, plaque-forming unit),分装后-20℃保存。
1.3 细胞培养:将GLC-82及A549 细胞均接种于含10%新生牛血清的RPMI 1640 培养基中,置5% CO2 、饱和湿度、37℃培养箱中培养。细胞为贴壁生长,0.125%的胰蛋白酶消化传代,1～2d换液一次。
1.4 实验分组:取对数生长期细胞,接种20×104个细胞于25ml的培养瓶中,培养24h 细胞贴壁后,再分成3组。对照组(A组):未经Ad-p53处理的RPMI 1640 完全培养基;实验组(B组)100MOIAd-P53感染细胞的RPMI1640 完全培养基; 72h后提取细胞总蛋白质。
1.5 Western blot 检测:用Bradford 法测定蛋白质浓度。分别取30μg 蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶15mA 电泳3h,30mA 半干转膜2h,5%脱脂牛奶室温封闭1h,接着分别与兔抗人p53 多克隆抗体(1∶500) 和羊抗人β2actin 单克隆抗体(1∶2000) 室温温育2h,然后分别与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体(1∶1000) 和兔抗羊IgG抗体(1∶5000) 室温温育1h,应用发光试剂盒显示蛋白质条带。
1.6 MTT比色法:取对数生长期的A549/DDP 细胞按1×104/孔接种于96孔培养板,每孔加液量200μL。24h 后换液,设空白调零组(不接种细胞)及实验组。每组设3个复孔。分别继续培养24、48、72h 后小心吸出培养液,加入MTT 试剂(5g/L)20μL, 空白调零组加入20μL PBS,继续培养4 h 后吸出上清,每孔加DMSO 150μL, 置水平摇床上摇15min后,在酶联免疫测定仪上选择波长490nm,空白孔调零,测定各孔吸光度A。计算细胞生长的抑制率:抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。根据直线回归法计算A549/DDP细胞的Ad-p53及DDP的IC50值。
1.7 统计学分析:采用SAS6.12软件进行计算。所有数据均以(x±s)的形式表示;P值为184.6MOI, 对GLC-82细胞为120.2 MOI。
2.3 Ad-p53对GLC-82 及A549 细胞周期及凋亡的影响:Ad-p53 转染GL-O82及A549细胞后能使细胞明显阻滞于G0～G1期, 而处于S 期细胞比例明显减少(P[1-4]。并且,有许多学者研究应用重组人p53腺病毒治疗非小细胞肺癌。Schuler[5]等以15例有局部转移的NSCLC患者为研究对象做了Ⅰ期临床试验。在支气管镜下经气管或CT引导下经皮将rAd-p53注射入瘤体内。治疗后在6例活检标本中检测到了外源野生型p53基因的表达,其中4例表现出注射局部肿瘤的生长在短期内受到明显抑制。Swisher[6]等对28例采用传统治疗病情继续恶化的非小细胞肺癌患者进行瘤内注射rAd-p53。25例可评价患者中2例肿瘤达到部分缓解, 16例肿瘤保持稳定2～14个月。
重组人p53腺病毒能治疗非小细胞肺癌,并在临床试验中取得了可喜成果。在非小细胞肺癌中P53的基因状态不同,在本研究中观察到基因治疗药物重组人p53腺病毒注射液(今又生) 能介导野生型p53 基因在人肺腺癌细胞GLC-82 中高效表达, A549 细胞中虽然含野生型p53基因,但外源p53基因能有效表达,文献报道用Northern blot 的方法观测到A549 细胞中内源p53 mRNA 有低水平表达[7],但我们用Western blot 方法未见明显p53蛋白的表达,这可能与内源p53蛋白半衰期短、表达量低有关。重组人p53腺病毒注射液对A549 及GLC-82细胞作72h的IC50值分别为184.6 MOI 和120.2 MOI, 它能明显促进细胞凋亡,阻止细胞周期于G0～G1 期,使S 期细胞比例明显减少。本研究表明,重组人p53腺病毒注射液可以抑制含突变型p53 基因及含野生型p53 基因的人肺腺癌细胞株的生长,促进其凋亡,作用效应不受内源性p53 状况的影响,为临床研究提供一定的理论依据。
参考文献
[1] 肖绍文,刘长清,孙艳,等.重组人p53基因联合放疗.热疗治疗晚期软组织肉瘤的临床观察[J].中国肿瘤临床, 2007, 3(2): 65-67
[2] Zhu Zhi-bing, Liu Ji-tang, Shui Jie, et al. Study of treatment advanced hepatobiliary carcinoma in Patients with rAd-p53[ J].Chin J InternMed, 2004, 3(11):1-14
[3] 汪进良,焦顺昌.重组人p53腺病毒治疗肿瘤临床研究进展[J].中国实用医药, 2008, 3(1):139-141
[4] 刘都户,刘文超,范黎,等.今又生联合热疗治疗浆膜腔恶性积液近期疗效[ J].中华肿瘤防治杂志, 2006, 13(14):1108-1109
[5] Schuler M,Herrmann R,DeGreve JL,et al.Adenovirus-mediated wild-type p53 gene transfer in patients receiving chemotherapy foradvanced non-small-cell lung cancer: results of a multicenter phase II study.J Clin Oncol,2001, 19(6):1750-1758
[6] Swisher SG,Roth JA,Komaki R, et al.Induction of p53-regulated genes and tumor regression in lung cancer patients after intratumoral delivery of adenoviral p53(INGN 201)and radiation therapy.Clin Cancer Res,2003, 9(1):93-101
[7] Inoue A, Narumi K, Matsubara N, et al.Administration of wild-type p53 adenoviral vector synergistically enhances the cytotoxicity of anti-cancer drugs in human lung cancer cells irrespective of the status of p53 gene[J].Cancer Lett, 2000, 157(1):105-112
作者单位:063300 河北省唐山市工人医院丰南分院肿瘤外科�1
063000 河北省唐山市工人医院 肿瘤内科�2
063000 河北省华北煤炭医学院第一附属医院肿瘤内科�3
063000 河北省华北煤炭医学院 4