李加凤，王兴武，王京群，李蕴慧，金忠元，陈玉霞，张慧慧
（青岛易邦生物工程有限公司 266114）
猫杯状病毒是杯状病毒科杯状病毒属成员之一，该科成员还包括水疱疹病毒属、兔嵌杯病毒属、诺如病毒属和沙波病毒属[1]，为单股正链RNA病毒，是引起猫科动物疾病的一种重要病原体，对环境耐受力较差，不易保存，在-10℃条件下只能保存2～3周，在-80℃条件下，保存2～3年，冻干毒可以长期保存。病毒无囊膜，病毒粒子大小35～40nm，正二十面体对称。FCV主要在胞浆中合成、成熟，呈晶格状排列[2]。主要引起上呼吸道症状，临床表现为精神沉郁、发热、眼鼻分泌物增多且多为脓性，结膜炎、口腔溃疡、支气管炎等，严重者还会引起患病动物的跛行，表现为不爱运动，关节肿大，头搁置于前腿，用手触摸可感受到关节处有液体，杯状病毒不仅可混合感染猫疱疹病毒，也常与其他病毒或寄生虫混合感染，使得诊断更加困难，病毒分离培养与RT-PCR以及电镜都是比较常用的方法。
2021年我们从崂山区一家宠物医院疑似感染杯状病毒的猫鼻腔试子中分离到一株猫杯状病毒FCV-LH，现将其分离、纯化、鉴定结果报告如下。
1.1 病料
采集崂山区一宠物医院疑似感染杯状病毒的猫鼻腔试子。
1.2 细胞
F81细胞购自ATCC。
1.3 试剂
DMEM培养基购自美国Gibco公司；
新生牛血清购自美国Hyclone公司；
琼脂糖，0.5%中性红购自Sigma公司；
猫抗体检测试剂盒为拜奥高试剂盒，购自附近的宠物医院；
消化液为0.25%胰酶-EDTA购自美国Gibco公司，0.01M/L的PBS为自行配制。其中生长液为含10%新生牛血清的DMEM细胞培养液，维持液为2%新生牛血清的DMEM细胞培养液。
2.1 病料采集与处理
2.1.1 病料来源 采集崂山区一宠物医院疑似感染猫杯状病毒的宠物猫鼻腔试子，低温取回后进行RT-PCR检测为猫杯状病毒阳性。
2.1.2 病料处理 用0.01M/L的PBS进行三倍稀释，-80℃/常温冻融三次之后，然后用涡旋振荡器将试子与病毒保存液充分混匀，然后挤压棉签，将棉签取出，鼻试子病料中杂质较少，直接12000r/min离心10min，取上清液，加入2000单位每毫升的双抗放置于2℃～8℃冰箱作用1h待用。
2.1.3 分离培养 取长满单层且状态良好的F81细胞，用0.01M/L的PBS或者无血清的DMEM清洗细胞2～3次，洗掉残余血清，取处理好的病料按5%比例接入，接入细胞之后轻轻晃动细胞培养瓶，使病毒液充分与细胞接触，适量加入无血清的DMEM，防止细胞在孵育的过程中干掉，影响病毒繁殖，然后放入接毒细胞培养箱孵育1h，孵育期间每15min轻晃培养瓶，充分浸润细胞，孵育完成之后取出细胞培养瓶，然后加入含2%新生牛血清的DMEM培养液进行培养。按此方式盲传三代。杯状病毒典型的病变特征为核固缩，一般表现为细胞圆缩、发亮、脱落，病料接毒之后培养时间一般为2～3d，如果盲传三代之后依然无病变，可判为阴性。如果盲传三代以后有明显且典型的病变，可进行RT-PCR检测进行复检。
2.1.4 初步鉴定 根据GenBank中已收录的FCV序列，参考艾纯旭硕士学位论文（艾纯旭，2013）中所使用的FCV鉴定引物，进行PT-PCR检测。上游引物5GGGCTTGATTGATACTGTTAC3，下游引物5CCCTAAAACCAGCAGCAC3（218bp）[3]，引物由上海生工生物合成。
取病变明显代次的细胞悬液200µL，用天根生化科技有限公司的DNA/RNA共提试剂盒按照说明书进行核酸的提取，之后做好标记。
RT-PCR扩增体系如下：
Onestep Enzyme Mix 1µL 2XOne-step Rection Solution A 12.5µL上游引物F 1µL下游引物R 1µL模板RNA 2µL ddH2O 7.5µL总体积 25µL
反应条件是50℃反转录30min，95℃预变性5min，进入循环之后，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环之后72℃大延伸3min。RT-PCR产物用0.1%的琼脂糖凝胶电泳进行检查。电泳时设置阳性对照和阴性对照，排除其他因素的干扰。
2.2 病毒纯化
2.2.1 DMEM营养琼脂的制备 第一层营养琼脂配制：用注射用水配制1.6%的琼脂121℃高压灭菌20min，置56℃水浴中待用；
将两倍浓缩的DMEM培养基置37℃水浴中待用。将56℃的1.6%灭菌琼脂与两倍浓缩的DMEM等量混匀即为第一层营养琼脂。
2.2.2 纯化方法 取长满单层且状态良好的F81细胞六孔板2个，用无血清的DMEM洗涤3次，尽量去除死细胞和残留血清。取代纯化病毒液，用无血清DMEM细胞培养液做10倍梯度稀释，取10-3～10-6四个梯度进行接毒培养，每个梯度2孔，0.5mL/孔，同时每块六孔板设置1～2孔健康细胞对照。37℃，5%CO2培养箱中吸附1h，每15min轻晃一下细胞瓶，使病毒液均匀覆盖。弃掉吸附后的病毒稀释液，并用无血清DMEM细胞培养液洗细胞2～3遍，以充分洗掉未吸附到细胞的病毒。每孔加入第一层营养琼脂约2mm，凝固后，将细胞置37℃，5% CO2培养箱培养，每6h观察接毒细胞的生长状态。开始出现CPE时，铺第二层含中性红的显色琼脂。第二层显色琼脂配制：用注射用水配制2.0%琼脂121℃高压灭菌20min，置56℃水浴待用。用时与37℃的两倍浓缩的DMEM等量混匀（含终浓度1/5000的中性红），即为第二层显色琼脂。
待琼脂凝固后，每2～3h观察一次，当出现清晰的蚀斑之后进行蚀斑挑选。挑选的时候用200ul的滴头挑出不同大小的蚀斑，连同琼脂一起接入长满单层的CRFK细胞的24孔板中，培养至CPE达75%以上时，收获，再次进行第二次蚀斑克隆纯化试验，如此纯化三代。
2.3 病毒的鉴定
2.3.1 RT-PCR检测 用2.1.4的方法进行PT-PCR检测是否有目的条带。
2.3.2 病毒的效价测定 取长满单层的F81细胞，消化之后接入96孔板，每孔100uL，标记好之后放入37℃，5% CO2条件下培养6～8h，取需要测定的病毒用2%血清的DMEM进行倍比稀释，稀释到10-8，吸出培养板中的废液之后，将稀释好的病毒液接入，每孔100uL弃去边缘孔，接中间的六个孔，并设置阴性对照，边缘孔加入维持液，标记好之后放入37℃，5% CO2条件下培养，每天观察病变情况并进行记录。到第5d的时候按Reed-Muench法计算TCID50。
2.3.3 病毒的致病性 取纯化后第三代病毒液，按Reed-Muench法计算TCID50，根据测定结果稀释到10-5.0TCID50/0.1mL；
取无猫杯状抗体的60日龄小猫7只，随机选取5只用于攻纯化后第3代猫杯状病毒，另外2只作为对照，两组猫在相同环境下隔离喂养，攻毒组每只猫滴鼻50µL，点眼50µL；
攻毒后第3d开始，每日观察猫的发病情况并记录。
病料处理之后接毒F81细胞第二代开始出现明显的细胞病变，第三代出现核固缩、圆缩、发亮的典型细胞病变。RTPCR初步检测有目的条带，且与阳性对照目的条带片段大小相同，阴性对照则无。进行第一代病毒纯化时，出斑时间从36～48h不等，蚀斑直径大小不一，挑取独立并且数量占优势的蚀斑进行后续纯化，三代纯化后均可在30h内开始出现蚀斑，取纯化之后的病毒上清液进行RT-PCR检测，有目的条带出现，与阳性对照目的条带片段大小相同，阴性对照则无。按Reed-Muench法计算TCID50，FCV-LH的TCID50为10-8/mL。纯化后3代病毒液按Reed-Muench法计算TCID50，FCV-LH的TCID50为10-8.5/mL。将病毒液体稀释攻毒后，第5天开始发病，主要临床症状为体温升高，精神不振，食欲下降，眼鼻分泌物增多，严重者糊住眼睛和鼻孔；
在观察期内未出现关节肿大的临床症状。发病照片见图1、图2。第7天有一只小猫出现口腔溃疡，流涎严重的临床症状，发病图片见图3。第7天也为发病高峰，截止第8天，共有4只小猫发病，一只未发病。症状持续到第9天左右开始陆续恢复，直到第14天，4只小猫基本完全恢复，恢复图片见图4。
图1 发病小猫眼分泌物增多
图2 发病小猫眼鼻分泌物增多
图3 发病小猫流涎、口腔溃疡
图4 发病小猫基本恢复
据统计，近几年宠物猫养殖数量越来越多，FCV呈世界性分布，虽然只有一个血清型，但由于病毒的不断变异，导致疫苗的保护力下降[4]，因此开展对猫杯状病毒的研究十分必要。
猫杯状病毒用F81细胞进行分离培养可以产生典型的细胞病变，稳定之后24～32h即可全部病变，具体病变表现为细胞发亮、圆缩、核固缩，最后成葡萄串样脱落。但是RT-PCR的方法只能检测是不是该病毒，而无法确定其毒力，按Reed-Muench法计算TCID50也仅说明了病毒含量，后续的动物回归试验证明了该病毒的致病力较强。
用蚀斑克隆纯化法进行纯化时，要求较高，铺琼脂的厚度以及琼脂温度需要进行准确地把控；
出斑挑斑时，斑太小，病毒不易繁殖，斑太大易夹杂其他病毒达不到纯化目的，所以蚀斑克隆纯化方法操作要求较高。纯化三代之后，取病毒液接长满单层的F81细胞，病变出现快且典型，在没有其他更好的纯化方法的前提下，用蚀斑克隆方法进行纯化也是比较可行的。
后续还需进行更加深入的研究，例如可以制苗看其免疫原性，然后综合分析之后看其是否可以用于制备疫苗产品，这对于新产品的开发还是比较有意义的。
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