[摘要]目的:研究乙型肝炎病人的YMDD变异情况。方法:采用双探针实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对46例HBV-DNA阳性的标本进行YMDD变异株的检测,其中未进行抗病毒治疗的20例样本,进行抗病毒治疗26例。结果:在26例抗病毒治疗的标本中检测出YMDD16例,在未经抗病毒治疗20例标本中检测出YMDD2例。这两组患者之间YMDD变异有显著性差异(P10,则判定为YMDD和野生株共存且YMDD突变株呈弱势。③如果二者之差≤5,则判定为完全YMDD突变株或YMDD突变株呈优势。
1.4 统计分析:用χ�2检验分析对抗病毒治疗组及未进行病毒治疗组的HBV-DNA的YMDD变异进行统计学分析。
2 结果
2.1 YMDD检测:FQ-PCR通过对DNA扩增过程中信号的连续监控,从而实现对DNA位点突变的检测。HEX探针设计横跨预计的突变位点;未发生突变的DNA模板由于与探针之间存在单个碱基不匹配造成结合能力下降,导致了荧光信号的降低;而发生位点突变的DNA模板与YMDD探针相匹配荧光信号正常。而FAM探针由于不经过突变位点,因此扩增效果不受HBV类型的影响,通过二者之间扩增后CT值的比较,可实现野生株与突变株的完全区分,达到检测突变的目的(见图1)。
2.2 YMDD检测结果(见表1):采用双探针FQ-PCR检测HBV-DNAYMDD变异株,在没有进行抗病毒治疗的20例中检测出YMDD2例;在进行过治疗的26例中检测出YMDD16例,经卡方检验二者有显著性差异。
进入细胞后磷酸化成三磷酸拉米夫定而发挥作用,作用的靶位是HBV的RNA指导的DNA聚合酶(RDDP,又称反转录酶RT)[6]。直接抑制HBVDNA聚合酶的作用和掺入病毒的DNA链中引起不可逆的链合成终止。然而长期用药对部分患者可导致HBVP基因区YMDD变异[7-10],使P基因区进行逆转录的活性部位中的552位蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)取代,生成YV552DD或YI552DD等,产生耐药突变。
拉米夫定治疗产生YMDD变异可能有以下机理:感染个体同时存在原型毒株(即YMDD)和不同的变异毒株群体(如YIDD、YVDD),在拉米夫定治疗过程中原型毒株迅速受到抑制,而使变异毒株逐渐成为优势毒株,即选择学说[11];另一种学说为诱变学说,即在拉米夫定的作用下HBV出现新的变异品种即YIDD、YVDD和YI/VDD。作者通过实验发现,在未使用拉米夫定治疗的患者中,即有10.0%(2/20)的YMDD变异阳性患者存在,而在经过拉米夫定治疗的患者中,YMDD变异率达到53.8%,从而可以支持第一种学说。目前大多数学者也都认同前一种学说。YMDD发生变异后,若继续用药治疗,部分患者可出现HBVDNA阳转,ALT升高,甚至出现黄疸和病情恶化,这部分患者则不适用于拉米夫定继续治疗。还有部分野生株和变异株同时存在的患者在停药一段时间后,野生株又成为优势株,这部分患者则可继续使用拉米夫定治疗[12、13]。本实验发现在未经任何药物治疗的乙型肝炎初发的患者中,YMDD的变异发生率在10.0%(2/20)左右,这部分患者本身就不适宜用拉米夫定治疗。因此对用拉米夫定治疗的患者在治疗前和治疗过程中动态检测HBV-DNA的载量及YMDD变异,则可以及时调整或改变治疗方案,而有助于提高CHB患者的治疗效果[14、15]。