[摘要] 目的:探讨酸-醇法从猪肺中提取胰岛素的研究方法。方法:将猪肺破碎后在低pH值溶液中,使胰岛素分子处于单体状态,利用酸-醇液将其萃取分离,通过盐析将其析出后进行分离纯化。结果:去除杂质蛋白、阴阳离子、热原性物质等,可得到胰岛素晶体,收率近0.006%。结论:从动物体内提取胰岛素,可用于人体降糖的特效药物,尤其是猪胰岛素与人胰岛素相近,对猪内脏器官有效开发,增加胰岛素生产原料来源,有一定研究价值。除了猪胰脏中含有丰富的胰岛素外,猪肺中也含有微量胰岛素。
[关键词] 胰岛素;萃取;盐析
[中图分类号] R-33 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)05(b)-016-02
The study of acid-alcohol method to extract insulin from the lung
SONG Xiaopei
(Mudanjiang University, Heilongjiang Province, Mudanjiang 157011, China)
[Abstract] Objective: To investigate the acid-alcohol method to extract insulin from the lung. Methods: The lung at low pH value after breaking solution to the insulin molecules in a single state, the use of acid-alcohol to extraction, precipitated by salting after its purification. Results: Remove protein impurities, ions, pyrogenic substances, available insulin crystals, almost 0.006% yield. Conclusion: Insulin extracted from animals can be used to hypoglycemic effects of human drugs, especially porcine insulin and human insulin is similar to the effective development of pig organs to increase the insulin production of raw materials, certain research value. Apart from pig pancreas is rich in insulin and the lung also contain traces of insulin.
[Key words] Insulin; Extraction; Salt
从动物胰脏中提取胰岛素是生物胰岛素生产的主要途径,且动物与人的胰岛素分子结构大致相同,因此,从动物体内提取胰岛素可用于人体降糖的特效药物[1-2]。尤其是猪胰岛素与人胰岛素相比,只有B30位的1个氨基酸不同,人的是苏氨酸,猪的是丙氨酸,其抗原性比其他来源的胰岛素要低。因此,猪胰脏已成为我国目前临床应用的胰岛素生产的主要原料来源[3]。据报道,猪肺中仍含有微量胰岛素,如果能有效提取,对于猪内脏器官开发利用,增加胰岛素生产原料来源具有一定的研究价值[4]。
1 材料与方法
1.1 一般材料
1.1.1 新鲜猪肺:猪体内取出2 h内处理。
1.1.2 硫酸:2.5 mol/L,生产厂家:哈尔滨市新达化工厂,产地:哈尔滨,生产批号:20050620。
1.1.3 硫酸铵、分析纯,生产厂家:天津市博迪化工有限公司,产地:天津,生产批号:20060805。
1.1.4 强碱性季铵Ⅰ型阴离子交换树脂201×7。
1.1.5 强酸性苯乙烯阳离子交换树脂001×7。
1.1.6 丙酮、分析纯,生产厂家:天津市博迪化工有限公司,生产批号:20080410。
1.2 器材
1.2.1 组织绞碎机,型号:FW100型,额定功率:50 HZ,转速:2 400 r/min。
1.2.2 离心机(沉降式),型号RH80-2,生产厂家:上海逸龙科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酸解:将新鲜猪肺用绞碎机破碎成泥状,加入5倍的水搅匀,用2.5 mol/L硫酸调节pH值到2,搅拌提取8 h后过滤。滤渣再用68%～70%乙醇和0.4%草酸提取2 h后分离,合并提取液[4-5]。
1.3.2 盐析:提取液中加硫酸铵盐析,加入量为277 g/L,不断搅拌,用5 mol/L硫酸调节pH值到1.5,放置12 h后过滤。滤液用氢氧化钠调节pH值到5.5,按225 g/L的量加入硫酸铵盐析,48 h后过滤,将2次滤得的沉淀物合并。将沉淀物用9倍的水溶解搅拌2 h,在冰箱中放置12 h后过滤,滤液中加入1/20倍50%三氯乙酸,快速加热至80℃,再冷却至30℃过滤(除去杂质蛋白),滤液用5 mol/L氢氧化钠调pH值至3,按610 g/L的量加入硫酸铵盐析,2 h后过滤,沉淀物用醋酸钠-硼酸缓冲液溶解,再按1 050 g/L的量加入硫酸镁盐析12 h,过滤取沉淀物[6]。
1.3.3 纯化:沉淀物用4倍水溶解搅拌,装入透析袋中,将透析袋放入10℃流动水中透析24 h。用硅藻土过滤,滤液中加入树脂搅拌20 min至无SO42-,过滤。滤液中加入0.9%的氯化钠和1.5倍量丙酮,析出沉淀,过滤。滤液加4倍量丙酮,放置12 h,析出沉淀,过滤。将几次沉淀物合并洗涤后干燥。再加入60倍量80%甲醇,冰浴2 h,过滤。按滤液体积1%的量加入300 g/L氢氧化钠溶液(浓度为30%)和5倍量丙酮,放置12 h析出沉淀。离心分离,沉淀物用丙酮洗涤后干燥,得粗牛胰岛素晶体。
1.3.4 去除热原:将粗牛胰岛素晶体用60倍水溶解,用5 mol/L氢氧化钠调节pH值到11,在冰箱内冷藏4 d后过滤,滤液用冰醋酸调节pH值到4～5,按300 g/L的量加入1%的氯化钠和5倍量丙酮,放置12 h析出沉淀。沉淀物用丙酮、乙醚洗涤后干燥即得牛胰岛素晶体。
1.3.5 原料收集与保存条件、处理条件:保持猪肺新鲜完整,保存时间不超过2 h,否则应速冻保存。提取前用组织绞碎机粉碎。胰岛素溶于稀酸,用酸-醇法提取,分离出胰蛋白酶,避免对胰岛素的降解作用。
2 结果
去除杂质蛋白、阴阳离子、热原性物质等,可得到胰岛素晶体,收率近0.006%。实验对比结果见表1。
3 讨论
盐析时用固体硫酸铵,加入时速度不能太快,应分批加入,并充分搅拌使其完全溶解,防止局部浓度过高。硫酸铵的加入量按如下公式计算,使硫酸铵处于饱和状态:X=,2次盐析时,pH值升高可使胰岛素表面电荷减少,接近等电点时沉淀量加大。
[参考文献]
[1]饶建华,陈廷胜,禹腾波.糖尿病治疗药物-胰岛素研究进展[J].中国实用医药,2009,12(29):169-170.
[2]徐鹃鹃,张宁.糖尿病治疗药物的研究进展[J].实用糖尿病杂志,2008,47(6):146-147.
[3]丁文.科学家有望从烟草中获得糖尿病治疗药物[J].临床合理用药杂志,2009,2(7):61-62.
[4]吴梧桐.生物化学[M].2版.北京:中国医药科技出版社,2006:315.
[5]史小利,李宗谦,徐淑霞,等.蛋清溶菌酶提取工艺研究[J].现代农业科技,2008,10(6):132-133.
[6]李萍.不同脂肪酸类型对糖耐量正常人群胰岛素敏感性的影响及其机制的研究[D].河北医科大学,2009:25-41.
(收稿日期:2010-03-11)