摘要：目的：为提高五味子药材的质量控制水平，建立北五味子药材的HPLC指纹图谱，并进行方法学考察。方法：用HPLC方法，在检测波长250nm下，以五味子醇甲为对照品，采用甲醇(A)、水(B)二元流动相进行梯度洗脱建立北五味子药材的HPLC指纹图谱。结果：在检测波长250nm下，北五味子药材共有8个共有色谱峰，且以甲醇(A)、水(B)二元流动相梯度洗脱的条件下，供试品出峰较多，色谱峰分离度良好，所建立的指纹图谱更具代表性。另对10个批次五味子药材指纹图谱进行了相关性考察及聚类分析，结果表明共有色谱峰相似系数均在0.999以上，10批样品间具有较高的相似度，可以继续扩大样品范围、数量。可用于建立北五味子的道地药材的HPLC指纹图谱模型并提高五味子药材的质量控制水平。结论：此方法精密度、稳定性、重复性均良好，且简便可行，可用于五味子药材的质量控制；
关键词：北五味子；HPLC指纹图谱；相似度；聚类分析
中图分类号：R284.1
文献标识码：A
文章编号：1007－2349(2010)06－0058－04
中药指纹图谱是以系统的化学成分或药理学研究为基础，采用化学测定或基因鉴定得到某种或某产地中药(制剂)所共有的、具有特异性的组分群体(某类或数类成分)特征图谱或图象。利用现代先进的分析技术来分析药材的整体特性，更准确地鉴别不同中药及识别中药本身的真伪和优劣。指纹图谱研究在质量评价方面应用的关注程度逐渐加强，可借助中药指纹图谱鉴别真伪药材及成品，评价原料药材、半成品和成品质量均一性和稳定性，目前对指纹图谱在中药材及中成药上的应用研究十分活跃，经常采用的方法有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法。
本试验采用高校液相色谱法建立五味子药材指纹图谱，分别对不同产地的五味子药材中木脂素类成分加以分析研究。探讨综合地控制五味子药材质量的方法，力求建立一种分析速度快、方法重现性好的指纹图谱研究方法，以提高五味子药材的质量控制水平，以更全面地保证药材质量，并为五味子的道地药材规范化研究提供基础研究资料。
1 仪器与试药
电子天平(岛津AT220)，紫外一可见分光光度计(岛津uv－265Fw)，超声波清洗器(上海必能信CQ－250)，高效液相色潜仪(美国安捷伦Agilent1100)。五味子醇甲对照品(批号：886200001，购自中国药品生物制品检定所)。甲醇(色谱纯)、重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。10批五味子药材分别采集于辽宁省新宾满族自治县五味子基地、丹东、桓仁、本溪等地，经本院植物教研室王冰教授鉴定，均为正品药材，药材来源见表1。
2 实验方法与结果
2，1 色谱条件 色谱柱：安捷伦C18(4.6×150mm)检测波长：250nm；流速：1.0mL／min。流动相：采用甲醇(A)、水(B)二元流动相进行梯度洗脱，流动相变化情况见表2。
2，2 对照品溶液的制备 取五味子醇甲对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1mL含0.2mg的溶液，摇匀，即得。
2，3 供试品溶液的制备 取不同批次的五味子药材粉碎，过三号筛，取粉末0.5g，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇约20mL，超声处理(功率250w，频率33kHz)20min，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2，4 HPLC图谱绘制 分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，在前述色谱条件下，绘制液相色谱图。测定结果提示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置处，其有相同保留时间色谱峰，并标定了8个与相邻组分分离度良好的共有色谱峰。
2，5 方法学考察
2，5，1 精密度试验考察 取同一供试品溶液(样品号1)，精密吸取10μL，连续进样5次，以各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的变化情况，考察试验方法与仪器的精密度。考察结果见表3、表4。
试验结果表明：主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的比值没有明显变化，仪器方法精密度良好。
2，5，2 稳定性试验考察 取同一份供试品溶液(样品号1)，精密吸取10μL，分别在0、2、4、6、8h进样分析，考察各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值，结果见表5、表6。
测定结果表明：8h内样品色谱峰面积无明显变化，其组分化学物质稳定。
2，5，3 重复性试验考察 取五味子药材(样品号1)5份，精密称定。按上述供试品溶液及测定方法进样操作，考察各主要色谱峰的相对保留时间和色谱峰的比值。测定结果见表7、表8。
结果表明：方法重复性良好。
3 指纹图谱及技术参数
3，1 共有峰的标定 取不同来源五味子药材(表2)，按照供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液备10／zL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，得到不同来源五味子药材的HPLC色谱图。在选定的色谱条件下，以五味子醇甲色谱峰的保留时间与峰面积值为参照，确定基准为1，分别计算不同批次五味子药材的色谱峰相对保留时间和相对峰面积的比值，根据色谱峰在不同样品中的共有率，结合成分分析和HPLC色谱图分析，标定了8个共有色谱峰，共有峰的相对保留时间(平均值)依次为1、1.4、1.8、2.0、3.1、3.5、4.3、4.6h。试验结果见表9。
3，2 共有峰面积比值 以供试品色谱中五味子醇甲的色谱峰面积面积作为1，计算各共有峰的相对峰面积。结果见表10。
测定结果提示：不同样品中相对峰面积差异较大，表明不同来源五味子药材之间质量差异较大。
3，3 相似度考察
3，3，1 谱峰匹配 本实验根据样品相对保留时间，结合样品指纹图谱的谱峰形状特点对标定的共有峰进行匹配，共标定8个共有峰。
3，3，2 相似度计算 采用平均矢量法对10个批次五味子药材指纹图谱建立共有模式，作为对照指纹图谱，将每张指纹图谱与其进行比较，并计算各个样本与基准样本的夹角余弦和相关系数，得到各图谱与对照指纹图谱的相似度。分析结果见表11。
结果可见，10个批次五味子药材指纹图谱的共有色谱峰相似系数均在0.999以上，表明10批样品间具有较高的相似度。同来源鉴别的结果基本一致，可以继续扩大样品范围、数量，以建立北五味子的道地药材的HPLC指纹图谱模型。
3，3，3 10批五味子药材指纹图谱聚类分析 选用平方欧氏距离作为样本间相似度测度，对样品的相对保留时间数据、相对峰面积数据进行分析，采用组间连接法为聚类方法对样品进行归类。分类结果见图1。
采用平方欧氏距离作为测度，进行样品数据的正态转换，按组间分析法将五味子药材分为2大类，样品(7、9号样品)和平均样品(11号)的距离较小。由聚类分析结果可知，可以根据不同样品与平均样品(基准样品)的距离值或利用相似系数对五味子药材样品进行定性鉴别分析。对于提高五味子药材质量控制水平、保证药材质量提供了有益的参考。
4 结论
本实验建立五味子药材指纹图谱，在选定的色谱条件下，以五味子醇甲对照品色谱峰为参照，根据在不同样品中色谱峰的出现频率，结合成分分析和HPLC色谱图分析，选定8个共有色谱峰，共有峰的相对保留时间依次为1、1.4、1.8、2.0、3.1、3.5、4.3、4.6h。可以通过对样品的共有峰采用聚类分析方法进行研究，初步确定北五味子药材的标准HPLC指纹图谱鉴别标准。
通过五味子药材指纹图谱研究可以看出，虽然同一地区的药材有相同保留时间的共有峰，但峰面积的比值有较大不同，说明同是作为北五味子药材入药使用，但在成分含量等质量评价指标上仍存在差异。
本实验采用HPLC－紫外检测法标定8个共有峰，经采用五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲随行对照，已确定其中3个共有峰的归属，由于时间与对照品的限制，还需深入研究五味子药材中其它共有峰的归属，以更好的控制药材质量。
本实验对提取溶剂进行了考察，分别试用乙醇、甲醇溶液作为提取溶剂，结果表明乙醇作为提取溶剂，所得色谱峰信息量较多。在样品粉碎粒度和超声提取时间上也进行了考察。曾试用甲醇－水(55：45)、甲醇－乙腈－水(10：35：55)、乙腈－水(45：55)、乙腈－水(1：1)等流动相系统进行筛选，结果表明乙腈－水(1：1)为流动相时，色谱峰峰形对称，分离度良好。本实验对流动相洗脱条件进行了筛选，先后采用不同比例的甲醇－水洗脱系统进行洗脱，同现行药典规定的含量测定项下流动相种类相同。而且在此流动相条件下，供试品出峰较多，色谱峰分离度良好，因此确立作为本实验流动相系统。