【摘要】 目的 研究聚偏氟乙烯(PVDF)膜分离地龙匀浆液最适宜的孔径。方法 以新鲜红地龙的匀浆液为分离对象，采用不同孔径的聚偏氟乙烯膜进行超滤，对超滤液进行蛋白浓度和蛋白分子量分布的测定。结果 截留分子量(MWCO)为50 000的膜对地龙匀浆液的超滤结果最好，其截留液蛋白浓度大，分子量分布在1．5～9 U之间。结论 用聚偏氟乙烯膜分离地龙匀浆液，这种常温下进行、不需添加其他化学试剂且操作时间短的方法对制备较高浓度地龙蛋白液是切实可行的。
【关键词】 地龙匀浆液；膜分离；超滤
在我国，很早以前就有用蚯蚓治病的记载，但对蚯蚓体内有效成分及药理作用的了解，还是运用近代科学技术分析研究的结果。蚯蚓含丰富的蛋白质和氨基酸，蛋白质占干重的56％~65％。目前发现蚯蚓具溶栓作用，其有效成分称为蚓激酶，蚓激酶为从地龙中提取的一组蛋白酶成分，大量研究表明蚓激酶无论静脉推注或口服给药，均具有溶栓作用，是目前较有开发前景的纤溶药物之一。蚓激酶能激活纤溶蛋白酶原，使之成为纤溶酶，这和尿激酶作用相似，其分子量在�12 000�～80 000之间,且在pH 5～9，20℃~55℃范围内稳定，可在常温下操作，稳定性较尿激酶高［1］。膜分离技术具有节能、高效、无相变化、操作方便、无二次污染等特点，是对传统分离技术的一次革命［2］。至今，膜分离技术在中药领域的应用远未达到应有的程度，在植物药研究中的应用才刚刚起步，在动物药研究中尚未涉及。本研究采用有机聚偏氟乙烯膜对地龙匀浆液进行分离，探讨合适的分离膜孔径。�
1 实验材料和试剂
聚偏氟乙烯膜(PVDF)：截留分子量(MWCO)为10 000、50 000、100 000，140 000购于上海应用物理研究所；鲜地龙：品种为赤子爱胜蚓(Eisenia foelide)，购于南京农业大学养殖场； 0．01％(W/V)考马斯亮蓝G-250，4．7％(W/V)乙醇，8．5％(W/V)磷酸；1 mg/ml标准蛋白质溶液(牛血清白蛋白)；低分子量标准蛋白质(上海伯奥生物科技有限公司产品)；0．05 mol/L Tris/HCl缓冲液(pH 8．0)；样品溶解液即0．01 mol/L Tris/HCl缓冲液(pH 8．0)；分离胶缓冲液(A液)，3．0 mol//L Tris/HCl缓冲液(pH 8．9)；30％丙烯酰胺(B液，Acr)，0．8％ N，N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)；浓缩胶缓冲液(C液，0．5 mol/L Tris/HCl缓冲液，pH 6．7)；1％四甲基乙二胺(TEMED，T液)；10％十二烷基硫酸钠(SDS)(S液)；1％过硫酸铵(AP)：电极缓冲液(内含0．1％SDS、0．05 mol/L Tris、0．384 mol/L 甘氨酸，pH 8．3)；0．1％溴酚蓝；甘油；固定液：甲醇�∶�冰乙酸�∶�蒸馏水＝3�∶�3�∶�4；染色液：0．46 g考马斯亮蓝R250溶于400 ml脱色液中，过滤备用；脱色液：80 ml冰乙酸，250 ml 95％乙醇，蒸馏水定容至1 000 ml；保存液：7 ml冰乙酸，加蒸馏水至100 ml。�
2 实验仪器设备
XHF-1内切式匀浆器，购于浙江宁波新芝科学仪器研究所；SCM超滤杯：膜有效过滤面积为3．32×10��-3� m�2，购于上海应用物理研究所新技术中心；高速冷冻离心机；721分光光度计；DYY-III713型电泳槽；直流双稳电泳仪；脱色摇床。�
3 实验操作�
3．1 过膜操作 取一定量的地龙，加入3倍量的二次蒸馏水，匀浆10 min，11 000 r/min×20 min 4℃离心，取100 ml离心后的地龙上清液，25℃、0．2 MPa条件下依次过一系列超滤膜进行分级过滤，膜材料孔径(MWCO)依次为140 000、�100 000�、50 000、10 000。当滤过液为80 ml时，往截留液中加入10 ml双蒸水，继续超滤，至滤过液体积为约100ml时停止。收集每一级超滤的滤过液和截留液，留待进行蛋白浓度测定和凝胶电泳分子量测定。�
3．2 地龙超滤液蛋白质浓度的测定 见表1。�
3．3 地龙超滤液分子量的测定 见表4。�
3．3．1 标准蛋白质的制备 按上海伯奥生物科技有限公司的说明书要求将标准蛋白(为6种蛋白质的混合体，分子量分别为14 400、20 100、31 000、43 000、66 200、97 000)开管分装，每管以20 μl置于小塑料离心管，-20℃保存。管内每种标准蛋白质的浓度为2 μg，用时加入等体积样品溶解液，沸水浴或恒温加热槽内加热3～5 min。�
3．3．2 地龙样品的制备 取10 μl地龙超滤液于小塑料离心管，加入等体积样品溶解液，处理方法同标准蛋白质。�
3．3．3 配胶 12％分离胶与5％浓缩胶按下表比例配制：
3．3．4 装胶 用0．5％琼脂糖将预备装胶的玻璃板周围密封，先装分离胶约10 cm，在加胶过程中避免气泡入内，随后在胶面覆以0．5 cm的水，约20 min后凝胶聚合完成，可见水与凝固的胶面出现折射率不同的界面。吸去胶面的水，装浓缩胶约2 cm，同样覆盖水层，放入加样梳，胶聚合后吸去水层。�
3．3．5 加样与电泳 用微量注射器向各加样槽中加入标准蛋白制备液或样品制备液约20 μl，上槽接负极，下槽接正极进行电泳，电流为40 mA。当溴酚蓝距管底约1 cm处时，停止电泳，切断电源，取出凝胶板。�
4 实验结果�
待测液离心上清液14万截留液14万滤过液10万截留液10万滤过液5万截留液5万滤过液1万截留液1万滤过液浓度2．40 2．152．052．042．109．290．0650．660
4．2 蛋白量分布 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定膜分级过滤所得滤液蛋白分子量分布如下：
1．M(标准蛋白) 2．1万滤过液蛋白样品
3．1万截留液蛋白样品 4．5万滤过液蛋白样品
5．5万截留液蛋白样品 6．10万滤过液蛋白样品
7．10万截留液蛋白样品 8．14万滤过液蛋白样品
9．14万截留液蛋白样品10．离心上清液蛋白样品
由蛋白浓度测定和电泳图可以看出，14万和10万膜的截留效果较差，蛋白质几乎全部滤过，过滤前和过滤后基本没有差别；5万膜的截留效果最好，大部分蛋白质都被截留下来，分子量分布在1．5～9 U之间；1 U膜截留液只能观察到1条分子量小的蛋白带。�
5 讨论
本实验采用的分离过滤条件是经过前期实验所确定，在该条件下，地龙匀浆液通过膜的膜通量最大，吸附最小，得率最高。由实验结果可知，地龙匀浆液含丰富的蛋白，通过有机聚偏氟乙烯膜进行超滤分离，可得到蛋白浓度更高的滤液。从不同孔径的膜滤液的浓度和蛋白分子量的分布结果来看，截留分子量大于100 000的膜对地龙匀浆液基本无截留作用，截留液和滤过液的蛋白浓度和蛋白分子量分布无变化，截留分子量为50 000的膜对地龙匀浆液的截留效果最好，能将绝大部分蛋白截留，将通过截留分子量为50 000的膜滤液再通过截留分子量为10 000的膜，发现能截留的蛋白量已经很少，这也证明截留分子量为50 000的聚偏氟乙烯膜可将地龙匀浆液中的蛋白成分很好地截留，与匀浆液相比，浓缩了将近4倍。结果表明，膜分离技术这种常温下进行、不需添加其他化学试剂且操作时间短的方法对制备较高浓度地龙蛋白液是切实可行的。
参考文献�
1 从玉文，刘耀明，陈家佩.蚓激酶的研究进展.中国生化药物杂志，2000，21(3)：159.�
2 黄仲涛.无机膜技术及其应用.中国石化出版社，1999：250.�
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