[摘要] 目的：为葱子药材质量控制提供一种多成分同时在线检测的分析方法。方法：应用高效液相色谱蒸发光散射检测法(IIPLC―ELSD)同时测定葱子药材中三个皂苷的含量。结果：皂苷A、B、c分别在73.4～1175.00μg/mL(r=0.9996)、96.25～1540.00μg/mL(r=0.9991)、110.00～1760.00μg/mL(r=0.9991)浓围内呈良好的线性关系；平均加样回收率分别为99.53％，99.08％，99.17％。结论：该方法分析时间短、专属性好、准确度高，可用于综合评价葱子药材的质量。
[关键词] 葱子药材；高效液相色谱蒸发光散射检测法；皂苷
[中图分类号]R286.0 [文献标识码]A [文章编号]1007―8517(2011)15―0039―02
葱子Semen Allii Fistulosi为百合科葱属植物葱Alliumfistulasum的干燥成熟种子。其性温，味辛，具有补中益精，明目散风的功效，用于。肾虚，目眩，风寒感冒等症。研究表明，葱中含有黄酮，甾体皂苷，生物碱，硫化物，脂肪酸等成分，主要用于抗菌及抗真菌，抗肿瘤，抗血小板聚集，抗氧化等。近几年备受关注的是其心血管活性，据报道，大葱提取物有抑制血小板的凝集，抗凝血素释放，调整血管紧张度以及降血压等作用。葱子药材资源丰富，广泛分布于全国大部分地区，受各地环境、土壤、气候等因素的影响，药材品质必定存在优劣差异。为了完善葱子药材活性成分的质量评价体系，本文在系统的化学成分研究和药理学研究的基础上，建立高效液相色谱一蒸发光散射法(HPLC―ELSD)测定了葱子三个主要皂苷的含量方法，为葱子药材的质量评价提供一种合理的方法。
1、仪器与试药
Waters2695高效液相色谱仪(美国，Waters公司)，包括四元泵，2998PAD二极管阵列检测器串联2420ELSD蒸发光散射检测器，自动进样器，Waters Empower 3工作站；KQ一500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SartoriusBP211D型十万分之一电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；乙腈为色谱纯(德国MERCK公司)，水为娃哈哈高纯水，其余试剂均为分析纯。
对照品葱子皂苷A、葱子皂苷B、葱子皂苷c均自制，用HPLC峰面积归一化法测定，纯度达98％。葱子药材由本人鉴定确认。
2、方法与结果
2.1 色谱条件
Waters Symmetry C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相为0.05％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0～3min，5％～22％B；3～16min，22％～23％B；16～30min，23％～27％B；；流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量20μL。ELSD检测器参数：漂移管温度为40℃；载气压力为3.5Bar。对照品及样品色谱图见下图。在此色谱条件下，3个目标成分能够很好地分离，峰形尖锐，无明显的杂质峰影响。
2.2 供对照品溶液的配制，上述3个成分的对照品减压干燥48小时取适量，精密称定，用乙腈溶解，分别配制成1.0mg/mL贮备母液；精密量取各成分母澉适量，按比例配成含3个成分的混标溶液，保存于4℃冰箱中，备用。
2.3 试品溶液的配制取葱子药材粉末5.0g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，称重。加入10mL纯水，浸泡过夜，超声处理30min，过滤，残渣再以10mL纯水超声处理30min，过滤，合并提取液，置100mL烧瓶中。减压浓缩，浓缩液置1mL容量瓶中，30％乙腈-水溶液定容至1mL，混匀，0.45μm微孔滤膜过滤，既得。
2.4 标准曲线和线性范围，上述混标溶液用30％乙腈依次稀释成系列浓度，摇匀，进样分析。每个浓度进样3次，取平均值。以浓度的常用对数LgC为横坐标(x)，以峰面积的常用对数LgA为纵坐标(Y)，做标准曲线。皂苷A线性方程：Y=1.5416x-0.5731(r=0.9996)表明葱子皂苷A在73.4和1175.00μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。皂苷B线性方程：Y=1.3618x-0.4576(r=0.9991)表明葱子皂苷B在96.25-1540.00μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。皂苷C线性方程：Y=1.2993x-0.4147(r=0.9991)表明葱子皂苷C在110.00-1760.00μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。
2.5 精密度试验精密吸取同一供试品溶液，一天内连续进样分析，计算日内精密度；连续三天进样分析，计算日间精密度。结果表明，各成分色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，日间精密度和日内精密度数据(RSD％)在1.20％～1.82％之间，说明仪器的精密度良好。
2.6 重复性试验取6份葱子药材粉末各约5.0g(产地：四川自贡)，精密称定，分别按上述方法制备样品溶液，测定三种有效成分的含量，计算其RSD％，进行重复性考察。结果表明，三个皂苷的峰面积的RSD％分别为0.80％，1.18％和1.23％，说明本测定方法的重复性良好。
2.7 样品溶液稳定性试验取一份制备的供试品溶液，在仪器不关闭的状态下，分别在0，1，2，4，8，12，16小时进样检测，观察其峰面积的变化。结果表明，三个种目标化合物的峰面积没有明显变化，表明样品溶液基本稳定，峰面积RSD均在3％以内。结果表明，样品在16h内的稳定性良好。
2.8 加样回收率实验取葱子药材粉术(产地：I四)U自贡)5.0g，精密称定，分别精密加入适量的对照品溶液，测定四种有效成分的含量，计算其RSD％，进行加样回收率考察，结果三个皂苷成分的平均回收率分别为99.53％，99.08％，99.17％。各成分平均加样回收率均大于95.0％，表明方法的准确性良好。
3、讨论
3.1 对照品的选择，由于药理学研究表明，皂苷类成份可能是葱子防治心肌缺血的活性成分。同时，研究过程中发现，葱子提取物的有效部位中主要含有包括上述四种皂苷在内的十种皂苷类成份。在同样的色谱条件下，药材中含量较高的成分为上述三种皂苷。因此，选择上述三种皂苷作为不同产地葱子药材含量的测定指标。
3.2 色谱条件的选择分别考察了甲醇一水系统流动相，但比较乙腈－水系统，其分离度较差，故选择乙腈－水系统作为流动相。实验过程中发现，降低流动相的pH有利于改善峰形，同时对色谱峰的分离度影响较小。当pH值在3左右时，其峰形较好，分离度稳定，所以最终确定流动相为乙腈一水(甲酸调节pH3.3)。实验中考察了25℃，30℃，35℃三种柱温，结果表明：温度为30℃时，三种成份的分离度较好。实验中尝试调节漂移管温度，载气压力的参数，但发现对色谱峰峰形，分离度改善不明显。因此选择了通用参数：漂移管温度40℃；载气压力3.5Bar作为ELSD的工作参数。
3.3 前处理条件的考察 由于含量测定考察的指标同为皂苷类成份，溶出特点相似。因此在前处理条件的考察，同时兼顾了四类成份的含量。选择了热回流，索氏提取和超声提取三种较常用的方法进行试验。结果表明，回流提取2h，索氏提取1h，超声提取1h后，葱子皂苷A，葱子皂苷B，葱子皂苷c的含量基本达到稳定，在增加提取时间含量增加没有明显差别。三种提取方法最终提取得到的有效成分葱子皂苷A，葱子皂苷B，葱子皂苷c的量没有明显差异，考虑到可能存在热不稳定性物质和出于操作简单的因素，决定采用超声提取作为葱子质控的提取方法。
参考文献
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