[摘要] 目的 通过miRNA介导RNAi沉默OPN表达探讨其对人肺腺癌细胞株A549顺铂(DDP)敏感性的影响。方法 利用体外构建的靶向OPN的miRNA表达质粒瞬时转染A549,酶联免疫吸咐法(ELISA)检测转染后48h细胞OPN蛋白表达;转染后24、48、72、96h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分别检测转染细胞和转染联合5μg/mL顺铂作用后细胞的增殖;于转染后24h联合不同浓度的顺铂作用48h,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果 (1)转染后48h,OPN蛋白表达水平下调了47.34%(P 1 材料与方法
1.1 材料
A549细胞株由本实验室保存,DMEM培养基购自Gibco公司,胎牛血清为杭州四季青公司产品。重组质粒PcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR-OPN/Negative、脂质体lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;质粒小提试剂盒购自Promega公司;大肠杆菌菌株One Shot TOP10购自北京全氏金公司;细胞蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天公司。人OPN ELISA试剂盒购自武汉博士德生物科技公司。大观霉素(spectinomycin)、四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品。顺铂购自山东罗欣药业公司。
1.2 方法
1.2.1 miRNA重组质粒的扩增与纯化 -80℃冰箱取出100μL TOP10冰上融化后每100μL加入特异性干扰质粒(miRNA-OPN)和阴性对照质粒(miRNA-negative control)各2μg混匀,冰浴30min。42℃水浴90s,冰上放置1min后加入37℃温育的LB培养基100μL,37℃ 200rpm/min水平振摇1h。各取100μL转化菌涂布于LB/spectinomycin(50μg/mL)固体琼脂平板上,37℃恒温过夜,单个菌落为转化菌落。用灭菌的10μLTip头各挑取3个单克隆菌落接种到LB/ spectinomycin液体培养基中,37℃摇菌过夜,设置不加转化菌的阴性对照。次日收集细菌,按说明书快速提取小量质粒DNA,紫外分光光度计测定质粒浓度和260/280吸光度比值。
1.2.2 肺腺癌细胞株A549细胞培养与转染 对数生长期A549细胞按5×105/孔移至六孔板,细胞80%融合时进行转染。实验分为未转染组、转染组和阴性对照组。未转染组不转染miRNA,转染组转染miRNA-OPN,阴性对照组转染miRNA-negative control,每组三个复孔。按照Lipofectamine 2000说明书操作,4h后更换完全培养基继续培养。
1.2.3 ELISA法检测OPN的表达 细胞转染后48h收集细胞加250μL蛋白裂解液于4℃,30min裂解细胞。BCA法总蛋白定量。取裂解上清液按OPN说明书操作,酶标分析仪测定450nm吸光度(A)值。CurveExpert1.3软件绘制标准曲线,并计算样品中OPN含量。
1.2.4 MTT法检测细胞增殖活性及细胞增殖抑制率 A549细胞在6孔板中转染miRNA后24h接种96孔板,细胞密度为(3×103)个/孔,每组细胞设6个复孔。培养24h后更换终浓度为5μg/mL DDP的DMEM培养液,分别在24、48、72、96h加入5 mg/mLMTT溶液20μL,继续培养4h后离心弃上清加入150 μL DMSO震荡10min,酶标分析仪测定490nm吸光度(A)值,作细胞增殖曲线。细胞增殖抑制率(inhibition rate,IR)的检测为转染后24h加入不同浓度的顺铂(0、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL)继续作用48h后测定吸光度(A)值,测定方法同上。设未转染的细胞作为对照,重复实验3次取平均值。IR的计算方法是(1-A试验组/ A对照组)×100%,计算细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50)。
1.3 统计学处理
统计学处理采用统计学软件 SPSS 13.0 分析,实验数据以χ±s表示,多组间参数采用单因素方差分析,多组间参数两两比较采用q检验,不同时点的计量资料处理应采用重复资料的方差分析。
2 结果
2.1 miRNA转染后OPN蛋白抑制
ELISA结果表明miRNA-OPN能有效沉默OPN蛋白表达。转染后48h转染组,未转染组和阴性对照组细胞蛋白水平分别413.47、785.20、759.93pg/mL。转染组降为未转染组的52.66%(F=274.88,P0.05);顺铂浓度分别为2.5、5、10、20 μg/mL时,转染联合顺铂作用组细胞增殖被明显抑制,差异均有统计学意义(F值分别为:31.22,67.53, 93.78,121.48,P RNAi广泛用于抑制基因表达和研究基因功能。它是指细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(dsRNA)时,mRNA发生降解而导致基因表达沉默。这种现象发生在转录后水平,又称为转录后基因沉默(PTGS)。RNAi可由miRNA和siRNA两种形式的小RNA介导。siRNA在肿瘤基因治疗方面取得了重大进展。研究表明靶向OPN的siRNA能有效沉默基因表达,使细胞生长速度减慢,侵袭和转移能力减弱,并抑制裸鼠体内肿瘤生长[10-14]。最近越来越多的研究人员通过模拟体内天然miRNA的成熟过程,利用带有polⅡ启动子的表达载体表达具有miRNA前体结构的shRNA来进行RNAi的研究,且具有更强的RNA干扰效应[15]。由慢病毒介导的miRNA干扰抑制肝癌细胞OPN蛋白表达从而使细胞生长速度明显减慢,细胞侵袭能力减弱[16]。本研究使用的干扰质粒由 Invitrogen公司构建,可在动物细胞内表达靶向调控OPN基因的miRNA。该质粒以鼠miR-154序列为骨架,且带有巨细胞病毒启动子,并优化茎环结构确保目的基因的高效敲除率。该质粒带有加强型绿色荧光蛋白(EmGFP)基因,可很方便地示踪miRNA的表达情况,并提供了EmGFP表达与miRNA基因敲除效率的强对比。本实验结果显示转染48h后,OPN蛋白水平下降了47.34 %。在转染48、72、96h后,转染组细胞生长曲线明显下移,细胞生长速度减慢。说明抑制OPN表达后,A549细胞的恶性增殖得到一定控制,为肺癌的基因治疗提供实验基础。
DDP是肺癌临床治疗的首选药物。它是细胞周期非特异性药物,可以和细胞内碱基结合,造成DNA结构和功能损伤,促进细胞凋亡。本研究结果显示,转染联合顺铂作用后细胞生长受抑制,与单纯DDP作用的细胞组相比,差异有统计学意义(P [13] Wu Y,DT Denhardt,SR Rittling. Osteopontin is required for full expression of the transformed phenotype by the ras oncogene[J]. Br J Can- cer,2000,83(2):156-163.
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(收稿日期:2009-11-24)