【摘要】 目的 分析利用蛋白质组学方法研究胃癌耐药相关蛋白质中双向电泳凝胶的染色显示。方法 培养胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/VCR，用双向凝胶电泳技术分离总蛋白，银染及胶体考马斯亮蓝染色，Image Scanner扫描仪扫描凝胶。结果 获得了背景清晰、重复性好的双向凝胶电泳图谱，两种染色凝胶相比，硝酸银染色在样品少时显示更佳，过量则影响图像质量，而胶体考马斯亮蓝染色在上样量增加时的凝胶蛋白质点数目及丰度均增加，并无明显拖尾。结论 两种显色方法受样品量影响较大，恰当选用有利于通过蛋白质组学研究胃癌耐药机制工作的进一步开展。
【关键词】长春新碱；胃癌；多药耐药；二维凝胶电泳；凝胶显色
Analysis for staining methods of two-dimentional patterns in drug resistant gastric carcinoma cells research
WANG Yu-jie,SU Tong-fu,YANG Yi-xuan.Department of Gastroenterology,Fifth People’s Hospital of Zhengzhou 450002,China
【Abstract】 Objective To investigate staining methods for two-dimensional gel(2-DE)electrophoresis in multidrug resistance of gastric cancer.Methods Cultured vincristine-resistant human gastric cancer cell line SGC7901/VCR and its parental cell line SGC7901．Variant amount protein of those cells were separated by 2-DE.Gels were stained with silver nitrate or colloidal Coomassie brilliant blue,and scanned by Image Scanner.Results Well-resolved,reproducible 2-DE patterns of SGC7901/VCR and SGC7901 were established.Silver staining was better when protein sample amount was low，overloaded protein will interfere resolution of the maps.Gels stained with colloidal Coomassie brilliant blue had more protein spots numbers and abundance without apparent trails when increased loading protein sample.Conclusion Two staining methods were influenced largely by the sum of protein samples，properly selection may be helpful for further study with proteomics in multidrug resistance of gastric cancer.
【Key words】Vincristine；Gastric cancer；Multidrug resistance；Two-dimensional gel electrophoresis；Staining
胃癌是常见的消化道肿瘤，确诊时多属中晚期，单纯手术效果较差，多需结合化疗，尽管目前已有多种化疗药物可供临床选择，而多药耐药仍是影响胃癌治疗的重要因素。有关耐药的具体机制尚不完全清楚，蛋白质组学是目前此方面研究的重要手段，双向凝胶电泳则是此新兴学科的支柱技术之一。为进一步明确胃癌多药耐药机制，我们分析了获得胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/VCR的双向凝胶电泳图谱的不同显色方法，为下一步研究工作的开展奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、超纯尿素、CHAPS购自Promega。2-DE蛋白定量试剂盒(2-D Quant Kit)、IPG缓冲液pH3-10及24 cm固相化pH梯度干胶条pH3~10、覆盖液均购自Amershan Pharmacia公司。二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺购自Sigma公司。考马斯亮蓝G-250购自USB公司，硝酸银、甲醛、戊二醛、硫代硫酸钠、碳酸钠和氯化钙均为国产分析纯。
1．1．2 仪器 IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT垂直电泳槽、Image Scanner扫描仪系Amersham Biosciences公司产品。全自动酶标仪购自美国BIO-TEK公司，水平摇床购自北京沃德生物医学仪器公司。
1．2 方法
1．2．1 细胞培养 胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的多药耐药胃癌细胞SGC7901/VCR系第四军医大学西京医院樊代明教授惠赠。SGC7901/VCR用含1．0 mg/L长春新碱的培养液培养以维持其耐药表型。
1．2．2 细胞总蛋白抽提 收集对数生长期的SGC7901和SGC7901/VCR细胞，加入细胞裂解液(8 mol/L尿素，4%CHAPS,40 mmol/L Tris,65 mmol/L DTT)4℃裂解2 h，12 000 r/min，4℃离心45 min后取上清即为细胞总蛋白质，用蛋白定量试剂盒(Amersham Biosciences)测定蛋白浓度,-80℃冻存备用，后室温裂解2 h，然后4℃12 000 g离心50 min，吸上清后分装并按说明用2-DE蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。5 μl胃癌SGC7901与SGC7901/VCR细胞蛋白质样品及倍比稀释的 2 mg/ml小牛血清标准品均取三管进行测定，用酶标仪在490 nm处读取OD值，取平均值作标准曲线并计算蛋白质浓度以减少实验误差。
1．2．3 双向凝胶电泳 配制平衡液储液(50 mmol/L Tris-Hcl pH 8．8、6 mmol尿素、30%甘油及痕量溴酚蓝)。取250、500 μg及1 mg蛋白质样品分别与水化液(8 mol/L Urea、4%CHAPS、40 mmol/L Tris、18 mmol/LDTT、0．5%IPG缓冲液pH3~10及痕量溴酚蓝)混合后上样，上样总体积为450 μl。然后进行固相pH梯度3~10等电聚焦电泳，具体参数设置为30V水化14 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 10 h。等电聚焦结束后将一橡胶条分别置于10 ml平衡A液(含0．2%DTT的平衡液储液)和10 ml平衡B液(含3%碘乙酰胺的平衡液储液)中水平摇床上各平衡15 min，然后转移胶条至12%的0．75 mm SDS-PAGE胶上端进行第二向垂直电泳。
1．2．4 硝酸银染色 剥离凝胶，蒸馏水短暂洗涤2次后进行硝酸银染色，基本步骤为40%乙醇+10%冰乙酸固定30 min；30%乙醇+6．8%醋酸钠+5%硫代硫酸钠+0．125%戊二醛敏化30 min；蒸馏水洗涤3次，每次 5 min；0．25%硝酸银+0．074%甲醛染色20 min；蒸馏水洗涤2次，每次1 min；2．5%碳酸钠+0．074%甲醛显影至斑点清晰,然后迅速用1．46%乙二胺四乙酸二钠终止显影10 min；蒸馏水洗涤3次，每次5 min；Image Scanner扫描仪扫描凝胶获取图谱。最后将凝胶置40%乙醇+4．6%甘油中保存。
1．2．5 胶体考马斯亮蓝染色 参照Candiano等的方法进行[1]。剥离凝胶，蒸馏水短暂洗涤两次后放入胶体考马斯亮蓝染液(0．12%考马斯亮蓝G-250+10%硫酸铵+10%磷酸+20%甲醇)水平摇床上染色12 h，然后蒸馏水洗涤至背景清晰。Image Scanner扫描仪扫描后凝胶至4℃保存。
1．2．6 图像分析 应用Image Scanner 扫描仪扫描染色的2-DE胶，以PDQuest 2-DE图像分析软件比较分析两种染色方法所获得SGC7901与SGC7901/VCR 细胞二维凝胶图谱的差异,为进一步改进优化实验提供信息。
2 结果
2．1 蛋白质浓度的测定 按照2-DE蛋白定量试剂盒说明测得的标准品及样品蛋白质吸光度、标准曲线及吸光度见表1和图1。所得回归方程为y=-0．007x+0．3828，将测得的SGC7901及SGC7901/VCR的蛋白质样品吸光度值代入回归方程，计算出所抽提蛋白质样品的浓度。
图1 蛋白质浓度测定标准曲线，纵坐标代表吸光度(OD)值，横坐标代表加样体积中蛋白质标准品的含量（μg）
2．2 通过第一向固相化pH梯度等电聚焦电泳及第二向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离了SGC7901和SGC7901/VCR细胞的总蛋白，分别经硝酸银染色和胶体考马斯亮蓝染色获得了背景清晰、重复性好的凝胶电泳图谱。两种不同染色凝胶图谱相比，银染凝胶上样量少(250 μg)的情况下可获得质量较高的图谱，随着上样量的增大，图的拖尾条纹逐渐增加而降低图谱质量，影响图像分析软件的分析，尤其是在上样量增大到450~500 μg以后则更为明显，且因银染显色的敏感性较高，上样量增大时显色所需时间明显缩短，致操作不易控制。经Candiano等改进后的胶体考马斯亮蓝染色增加了显色的敏感性，胶体考马斯亮蓝染色在上样量小(500 μg以下)时所获图谱的蛋白质点数少于银染，而上样量的增大后，考马斯亮蓝G-250染色凝胶的蛋白质点数目及丰度明显增加，且无明显拖尾条纹出现，即使上样量增大至1 mg所获图谱质量仍较高。见图2，3。
3 讨论
多药耐药是影响胃癌等恶性肿瘤化疗效果的重要因素之一，其具体机制十分复杂，涉及多个方面，如药物经细胞膜外排增多使细胞内药物浓度降低，药物在细胞内的亚细胞分布发生改变使药物不能到达靶位置，肿瘤细胞的胞内解毒系统、DNA损伤修复系统及抗凋亡系统的能力增强等[2]。现已发现的耐药相关蛋白有多药耐药相关蛋白、肺耐药蛋白、p170 糖蛋白、拓扑异构酶、蛋白激酶C、谷胱甘肽S转移酶、超氧化物歧化酶等[3-4]。但以上研究结果都不能完全解释肿瘤多药耐药现象，因此采用新方法和技术开展肿瘤多药耐药性研究仍是目前的重要课题之一。
随着人类大规模基因组计划草图测序工作的完成，以蛋白质学研究为主要标志的后基因组时代来临。蛋白质组学为肿瘤药物治疗靶标的发现及抗肿瘤药物的筛选提供了新的技术平台[5-6]。虽然调控生命活动的源头是基因，但作为基因表达终末产物的蛋白质才是肿瘤细胞周期、凋亡及转移的调控的直接参与者，因此从蛋白质水平探索肿瘤发生发展及药物作用的分子机制，是当今肿瘤研究的新热点。利用蛋白质组学高通量的特点，有望筛选出新的胃癌耐药相关蛋白质，避免了常规研究方法的偶然性。
双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是等电聚焦(isoelectric focusing)电泳和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrohporesis，SDS-PAGE)的结合应用，前者基于蛋白质等电点差异分离蛋白质，后者则按蛋白质分子量大小的不同进一步纵向分离蛋白质[7]。它的出现为蛋白质组学的发展奠定了基础，目前仍是分离蛋白质最常用的技术之一，在功能蛋白质组学研究中发挥着重要作用。我们利用双向凝胶电泳技术分别分离了用SGC7901与SGC7901/VCR细胞的总蛋白，经凝胶染色，建立了相应的双向凝胶电泳电泳图谱，以进一步寻找与胃癌耐药相关的差异表达蛋白质点。双向凝胶蛋白质的染色方法有多种，最常用的是硝酸银染色和胶体考马斯亮蓝染色。二者相比硝酸银染色的优点是灵敏度高，在上样量小的情况下可获得蛋白质点数较后者多，但银染受上样量影响明显，一般为100~250 μg，增加上样量则易出现浓重的条纹，降低分辨率从而影响后续图像分析软件的进一步分析，且与质谱鉴定的兼容性较考马斯亮蓝染色低。经典的胶体考马斯亮蓝染色虽然与下游质谱鉴定的兼容性较好，但显色灵敏度低。Candiano等改进后的胶体考马斯亮蓝染色方法明显增加了显色的灵敏性，本研究的结果也印证了这一点。
总之，二维凝胶电泳中银染和胶体考马斯亮蓝染色各有优劣，蛋白质上样量的大小是影响图像的重要因素，如果样品上样量较大时，选择胶体考马斯亮蓝染色可将较好的质谱鉴定兼容与图像分辨性能相结合，有利于低丰度表达蛋白质的展示与鉴定。
参考文献
［1］ Candiano G,Bruschi M,Musante L,et al.Blue silver:a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.Electrophoresis,2004,25(9):1327-1333.
［2］ 田怀平.实体瘤多药耐药的发生机制.中国医院药学杂志,2006,26(5):607-609.
［3］ Zhang D,Fan D.Multidrug resistance in gastric cancer:recent research advances and ongoing therapeutic challenges.Expert Rev Anticancer Ther,2007,7(10):1369-1378.
［4］ Lacueva J,Perez-Ramos M,Soto JL,et al.Multidrug resistance-associated protein(MRP1)gene is strongly expressed in gastric carcinomas.Analysis by immunohistochemistry and real-time quantitative RT-PCR.Histopathology,2005,46(4):389-395.
［5］ Lage H.Proteomics in cancer cell research:an analysis of therapy resistance.Pathol Res Pract,2004,200(2):105-117.
［6］ Righetti PG,Castagna A,Antonioli P,et al.Proteomic approaches for studying chemoresistance in cancer.Expert Rev Proteomics,2005,2(2):215-228.
［7］ Schramm A,Apostolov O,Sitek B,et al.Proteomics:techniques and applications in cancer research.Klin Padiatr,2003,215(6):293-297.