【摘要】 目的探讨糖尿病视网膜病变与诱导型一氧化氮合酶的表达的关系并探讨还原型谷胱甘肽对诱导型一氧化氮合酶表达的影响以及对糖尿病视网膜病变的防治作用。 方法雄性SD大鼠70只随机分成对照组10只,糖尿病1、3、6月组以及还原型谷胱甘肽干预3、6月组各12只。分别留取视网膜标本,部分标本观测视网膜病理改变;部分标本采用免疫组化法测定诱导型一氧化氮合酶表达。 结果视网膜病理结果显示:与正常对照组相比,糖尿病1、3、6月组视网膜病理改变逐步加重;免疫组化分析结果显示诱导型一氧化氮合酶表达在糖尿病各组均明显增强( P [1]。
一氧化氮(NO)能调节许多重要的生理过程,包括神经传递、血管舒张等,是视网膜血管功能的重要调节因子,在糖尿病视网膜病变患者及动物模型中都发现一氧化氮水平升高。一氧化氮合酶催还L�精氨酸生成一氧化氮,而诱导型一氧化氮合酶(iNOS)产生过多的一氧化氮已经被证明在包括糖尿病视网膜病变在内的许多眼科疾病中发挥重要作用。
本实验旨在探讨糖尿病视网膜病变与iNOS的表达的关系并探讨还原型谷胱甘肽对iNOS表达的影响以及对糖尿病视网膜病变的防治作用。�
1 材料和方法�
1.1 糖尿病动物模型的建立及分组 实验动物为生后6周、体重180~200 g的雄性SD大鼠70只,本院实验动物部提供。大鼠随机分成对照组10只,糖尿病组36只(1、3、6月各12只),干预组24只(3、6月各12只)。糖尿病组、干预组鼠按60 mg/kg的剂量一次性腹腔内注射链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司),3 d后使用血糖仪(强生公司稳豪型)测空腹血糖达16.6 mmol/L以上,且尿量及饮水明显增多鼠为糖尿病大鼠模型。对照组仅腹腔内注射同样体积的0.1 mmol/L的柠檬酸缓冲液。对于血糖过高或体重下降过快的大鼠每周接受4~5次,每次1~2u中效人胰岛素(优泌林N)皮下注射,以防止酮症或体重下降过快[2]。干预组大鼠每天以100 mg/kg的剂量腹腔注射还原型谷胱苷肽(商品名:阿拓莫兰,重庆药友制药公司)。实验结束时,去除中间死亡鼠和血糖恢复鼠进行实验统计。
1.2 一般组织学处理 观察期满后分批用水合氯醛过量麻醉处死大鼠,轻摘眼球,将右眼球固定于10%中性福尔马林中48 h,经乙醇常规脱水,二甲苯透明后浸蜡包埋。连续4 μm厚切片,用于HE染色;取左眼球迅速剥离视网膜放置于液氮中保存。�
1.3 诱导型一氧化氮合酶的表达 免疫组织化学测定诱导型一氧化氮合酶表达:取石蜡切片,常规脱蜡、水化,抗原修复,3%H2O2孵育,血清封闭,PBS冲洗,滴加1:100稀释的iNOS抗体,4℃放置过夜,PBS冲洗,滴加生物素化二抗,37℃孵育10 min,PBS冲洗;滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素,37℃孵育15 min;DAB显色,苏木素复染,中性树脂封片。应用HPIAS•1000型高清晰度彩色病理图像分析系统,进行免疫组化图像分析:经标准灰度校正后,每张切片随机取5个视野,测定阳性染色物质的平均吸光度值,以每组的平均吸光度值进行比较。�
1.4 统计分析 数据以均数±标准差( x ±s )表示。数据处理采用SPSS统计软件(11.0版)在计算机上进行。所有数据采用方差分析及 t 检验, P 16.5 mmol/l,与对照组相比体重增加明显减低,而干预组大鼠血糖及体重与糖尿病组无明显差别(见表1)。�
表1
注:�*与当月对照组相比有显著差异( P 0.05) �
2.2 视网膜病理改变 1月组与对照组比较形态无明显改变;糖尿病3月组鼠视网膜节细胞层及内核层水肿,尤其是在静脉血管周围细胞排列紊乱,管径不规则,呈节段性膨大,可见到闭塞的无细胞毛细血管,但未见血管瘤、细胞栓塞、出血。糖尿病6月组视网膜水肿较3个月重,尤其内核层细胞排列紊乱,内核层血管周围水肿更明显,节细胞数量减少,可见毛细血管管径粗细不均重于3个月组,闭塞的毛细血管既无内皮细胞也无周细胞,管腔闭锁,管径粗细不等,管壁边缘不规则,其周围可见扩张。干预组与当月糖尿病组比较病理改变减轻。�
2.3 诱导型一氧化氮合酶检测结果 正常对照组6月时处死取标本,大鼠视网膜内几乎没有阳性细胞表达,糖尿病1月组大鼠iNOS 主要表达于视网膜的内核层及内界膜,呈较强阳性反应,在3 个月时,iNOS 阳性表达显著增强,呈弥漫的深棕色强阳性反应,在视细胞层和外核层也可见颗粒状阳性着色,6个月时阳性率及范围进一步提高;还原型谷胱甘肽干预组所有大鼠与同期糖尿病3、6个月组相比,iNOS 阳性表达的程度和反应区域显著减少,阳性着色降低的部位也主要发生在内界膜和外核层之间。
表2
注:糖尿病组与对照组相比有显著差异( P [3]。在正常视网膜组织中iNOS几乎无表达,但在内毒素、细菌脂多糖,1L�1,缺血等因子刺激下可表达于视网膜内皮细胞、周细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞等细胞胞浆之中,起细胞抑制和细胞毒性作用[4]。
我们研究的结果发现,iNOS的阳性细胞在正常大鼠视网膜几乎不存在;随着糖尿病进程发展,1月时阳性细胞散在分布于大鼠视网膜组织;而糖尿病3月的大鼠视网膜内阳性细胞数显著增多;到糖尿病6月时持续升高。iNOS参与糖尿病视网膜病变的发生和发展。
目前针对糖尿病视网膜病变病因的治疗均处于实验研究阶段。有研究发现在致糖尿病大鼠高血糖一段时间后再控制血糖视网膜氧化应激只能部分有效。
谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽,分为还原型及氧化型两种。生物学作用主要通过还原型谷胱苷肽实现。GSH是机体重要的还原剂,可保护蛋白质和酶分子中的巯基不被氧化,使它们处于活性状态。许多研究已经证实糖尿病视网膜中氧化应激增强,GSH水平下降[5]。我们利用还原型谷胱苷肽这一确切抗氧化剂作干预研究,结果显示:与当月糖尿病组相比较视网膜iNOS表达明显降低,且视网膜病理改变均减轻。提示还原型谷胱苷肽可以降低糖尿病大鼠视网膜组织iNOS的表达,并减轻视网膜病理改变的发展,对糖尿病视网膜具保护作用。研究还发现,还原型谷胱苷肽治疗组大鼠平均血糖水平与糖尿病组无差异,提示其拮抗iNOS的作用并不是通过降低血糖而实现的。
糖尿病视网膜病变发病机制还未完全明确,针对不同的发病机制进行的干预研究效果不一。我们的研究发现抗氧化剂还原型谷胱苷肽有效抑制了视网膜iNOS的表达,使视网膜病理改变减轻,从而达到视网膜保护的目的。
参 考 文 献 �
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