[摘要] 目的 探讨肾脏穿刺活检标本免疫荧光染色制作方法及意义。方法 采用直接法检测1006例肾脏穿刺活检组织IgG、IgA、IgM、C3、Fib、C1q免疫荧光染色;其中150例采用间接法检测HBsAg、HBcAg免疫荧光染色。结果 在荧光显微镜下观察荧光附着部位与强度(-～++++),对照片阴性。免疫沉积物定位准确、清晰、灵敏度高、特异性强,结果易于判断。结论 直接免疫荧光染色法染色步骤简单,对荧光标记物的分布部位、分布形式、荧光强度显示极为明确,可提高各种免疫肾病的检出率,为国际上公认的肾活检病理诊断和研究的重要染色手段,值得推广应用。
[关键词] 肾脏; 穿刺; 活检标本; 免疫荧光
[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2009)33-154-02
免疫荧光技术对肾脏疾病的诊断及其分类具有极其重要的作用,在肾活检病理诊断中的地位是其他组织化学、电子显微镜检查等无法替代的。应用冰冻切片进行直接免疫荧光检查,被认为是肾活检免疫病理检查的重要方法[1-3]。我科从2002年8月～2009年6月行1006例肾穿活检免疫荧光染色,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 一般材料
福建医科大学附属第一医院肾脏穿刺活检组织,恒温冷冻切片,3～4μm厚,备用。
1.2 试剂
①直接法兔抗人荧光抗体IgG(1�50)、IgA(1�40)、IgM (1�40)、C3(1�40)、Fib(1�40)、C1q(1�40);间接法第一抗体鼠抗人HBsAg(1�50),第二抗体为FITC标记抗鼠荧光抗体(1�75);间接法第一抗体兔抗人HBcAg(1�50),第二抗体为FITC标记抗兔荧光抗体(1�75)。购自DAKO公司。②Polyclonal Rabbit Albumin/FITC(1:50)购自DAKO公司。③0.01mol/L(PH 7.2～7.4)PBS。④抗体稀释液(S3022DAKO公司)。⑤缓冲甘油:1份0.1mol/L(PH 8.0)PBS与9份甘油混匀。
1.3 仪器
Leica CM3050冷冻切片机,Olympus BX61荧光显微镜+ DP70数码摄像。
1.4染色步骤
直接法检测IgG、IgA、IgM、C3、Fib、C1q。①肾组织冷冻切片在室温下稍风干后,在室温下用冷丙酮固定10min。②PBS冲洗2×3min。③滴加兔抗人的荧光抗体IgG、IgA、IgM、C3、Fib、C1q,设立Albumin作对照排除。④室温下避光孵育40min。⑤PBS冲洗2次×3min。⑥缓冲甘油封片。
间接法检测HBsAg、HBcAg步骤,①～⑤同直接法。⑥分别滴加FITC标记抗鼠荧光抗体和FITC标记抗兔荧光抗体。⑦室温下孵育30min。⑧下同直接法⑤～⑥。
2 结果
荧光显微镜下观察肾组织荧光附着部位与强度。阳性染色呈颗粒状或团块状或线状翠绿色沉积[1]。对照片阴性。强度分为6级:-:阴性;±:高倍镜下隐约可见;+:低倍镜下隐约可见,高倍镜下可见;++:低倍镜下可见,高倍镜下清晰可见;+++:低倍镜下清晰可见,高倍镜下耀眼;++++:低倍镜下耀眼,高倍镜下刺眼。免疫沉积物定位准确、清晰、灵敏度高、特异性强,结果易于判断。如图1～4。
3 讨论
肾穿刺活检组织冷冻切片免疫荧光染色特异性强、敏感性高,染色步骤简单,节省时间,定位准确,强度易于判读,是一种最简便、快速的方法[2]。直接法:用已知特异性抗体与荧光素结合,制成特异荧光抗体,直接用于细胞或组织抗原的检查。此法特异性高,缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原,敏感性差,但此法非常实用,应用也广泛。间接法:先用特异性抗体与细胞标本反应,随后用PBS洗去未结合的抗体,再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合,形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原-抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法,从而提高了敏感性[4]。
免疫荧光染色受到固定剂、温度、时间、抗体效价等很多因素的影响[3-8] 。因此,在实际工作中应注意以下几点:(1)将取好的新鲜肾组织不经任何处理置于少许浸湿生理盐水的纱布上放入Ependorf管内后转入含有冰袋的保温箱内保存(或者冰壶),并尽快送检,避免组织干涸,并且以不超过24h检查为宜,保持抗原的活性。(2)临床医生取得肾组织后迅速在放大镜下观察,切割肾皮质3～4mm,确保组织中含有肾小球。(3)临床处理标本时应避免固定液交叉腐蚀荧光组织,防止出现假阴性。(4)如果不能马上切片,短时间内可将标本置4℃冰箱内保存,较长时间应置于-70℃低温冰箱内,以保持抗原活性,防止抗原移位或丢失,但在低温冰箱中放置的时间不宜超过2d。(5)冷冻切片方法:将OCT包埋剂滴到金属支持器上,待其凝固后修平,将细条状肾组织放平,并在周围滴上少量的OCT,冷冻后切片,厚约3～4μm,将肾组织旁边的多余OCT用刀片修去,有利于切片。(6)加抗体前,先切片一张预染HE,看是否有肾小球,如无肾小球将影响结果判定。(7)对新购买的荧光抗体,应根据说明书进行预实验,确定工作浓度。(8)抗体应现用现配,因为稀释后的溶液中抗体及酶的有效活性会很快降低。(9)荧光抗体的保存,以0～4℃保存,防止抗体活性降低和蛋白变性。(10)用抗体稀释液(S3022DAKO公司)稀释抗体,可以减少背景染色。(11)湿盒内加入适量的蒸馏水,以防止染色过程切片干燥。(12)用Polyclonal Rabbit Albumin/FITC作对照,目的是非特异性荧光染色可通过此对照进行鉴别与排除。(13)抗体孵育要避光,以保证荧光不易淬灭。(14)观察结果,最好在暗室观察,在有光线环境,荧光比较容易淬灭。(15)技术员应掌握荧光观察方法,并与医生很好地沟通,发现不足,及时纠正,做好室内质控。
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(收稿日期:2009-06-18)