[摘要] 目的 探讨糖基化终产物(AGEs)对体外培养兔视网膜Müller细胞表达碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的影响。方法 体外分离并培养兔视网膜Müller细胞。37℃条件下制备牛血清白蛋白AGEs（AGEs-BSA）及其对照物。应用AGEs-BSA及其对照物作用于Müller细胞，采用免疫细胞化学(ICC)方法半定量检测AGEs对视网膜Müller细胞表达bFGF的影响。结果 与对照组相比，AGEs作用下体外培养的兔视网膜Müller细胞bFGF的表达增高(P且具有一定的时间和浓度依赖性。结论 AGEs可以上调Müller细胞表达bFGF，推测AGEs可能通过增加bFGF的表达从而加速糖尿病视网膜病变(DR)新生血管的形成。�
[关键词] 糖基化终产物；碱性成纤维细胞生长因子；视网膜Müller细胞；免疫细胞化学�
[中图分类号] R774.1;R-33 [文献标识码] A
[文章编号] 1671-7562（2008）02-0107-04��
Effect of advanced glycosylation end products on expression of basic �
fibroblast growth factorin cultured rabbit retinal Müller cells��
AI Jing�1,LIU Yao�1,LUAN Jie�1,CHEN Ping-sheng�2
(1.Department of Ophthalmology,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China;2.Department �
of Pathology,School of Basic Medical Science,Southeast University,Nanjing 210009,China)��
Abstract:Objective To investigate the effect of advanced glycosylation end products(AGEs)on expression of basic fibroblast growth factor(bFGF)in rabbit retinal Müller cells in vitro.Methods Rabbit retinal Müller cells were cultured according to the descriptions in literatures.AGEs-BSA and its control were made in 37℃ in vitro.Müller cells were divided into AGEs-BSA group,AGEs-BSA control group and blank control group.AGEs-BSA group and AGEs-BSA control group were respectively treated with 5 different concentration series of AGEs-BSA and AGEs-BSA control for1,3,6 and 9 days,while blank control group was incubated without any intervention.Then bFGF expression in Müller cells was half-quantitatively detected by immunocytochemistry(ICC).Results Comparing with blank control and AGEs-BSA control group,AGEs-BSA evoked a time and concentration-dependent increase of bFGF expression by retinal Müller cells.Conclusion AGEs might promote the neovascularization of diabetic retinopathy through up regulating the expression of bFGF in Müller cells.�
Key words:advanced glycosylation end products;basic fibroblast growth factor;retinal Müller cells;�immunocytochemistry�
(Modern Medical Journal,2008,36:107-110)��
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病最常见、最严重的并发症之一。糖尿病患者葡萄糖代谢发生异常，产生大量糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGEs)。传统观点认为AGEs集中作用于视网膜血管系统，导致血-视网膜屏障功能的损害，进而产生不同程度的DR。视网膜Müller细胞在维持视网膜结构和功能上具有重要作用，但长期以来关于AGEs对该细胞作用的研究较少，而碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)在Müller细胞参与的视网膜多种病理过程中具有重要作用。因此，本实验拟通过观察AGEs对视网膜Müller细胞表达bFGF的影响，进一步探讨DR的发生机制。�
1 材料和方法�
1.1 细胞培养�
参照刘瑶等[1]报道的方法并稍加改进进行Müller细胞的分离培养并鉴定。简述如下：取健康新西兰大白兔，重约2.0~2.5kg，雌雄不限(由东南大学医学院动物实验中心提供)。经耳缘静脉注入空气处死，无菌条件下摘除眼球，快速解剖分离视网膜，制成微小组织块进行贴壁培养。细胞培养液为含20％胎牛血清的DMEM培养液。培养环境为恒温恒湿培养箱�（37℃，体积分数为5%CO�2）。�
1.2 牛血清白蛋白糖基化终产物（AGEs-BSA）及AGEs-BSA对照物的制备与检测�
AGEs-BSA的制备参照我校心血管研究所制备AGEs-BSA的方法进行[2]。AGEs-BSA对照物的制备，除不加无水葡萄糖外，其他与制备AGEs-BSA相同。孵育完成后，将AGEs-BSA及其对照物用荧光分光光度计（Varian Cary Eclipse,美国）测定其荧光值（pH 7.4，0.2μmol•L-1 PBS用于调零，激发波长360nm，峰峡5nm，发射波长450nm）。AGEs-BSA的荧光强度较AGEs-BSA对照物约高12倍，证实AGEs-BSA制备成功。最后将制备物用0.2μm针头滤器过滤灭菌封口后置4℃冰箱中待用。�
1.3 AGEs-BSA作用观察�
1.3.1 实验分组�
原代兔视网膜Müller细胞达80%融合状态时，予以0.25%胰蛋白酶消化,用含20%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液并调整细胞浓度约为1×105个•ml-1，接种于预置有盖玻片的六孔培养板中，置于培养箱中培养，而后分为AGEs-BSA实验组、AGEs-BSA对照组及空白对照组分别干预。根据AGEs-BSA及其对照物浓度（以两者占培养液的体积分数表示）又分别设4%、8%、16%、32%、64%各5个亚组。�
1.3.2 bFGF免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)�
分别于1、3、6、9d时取出部分盖玻片，pH�7.2～7.6PBS清洗，冰丙酮固定，PBS冲洗，3% H�2O�2阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗，5%BSA封闭液封闭，甩去不洗；加入兔源抗兔bFGF多克隆抗体，阴性对照加PBS，4℃保湿过夜；PBS冲洗，加入羊抗兔IgG二抗（亲和纯化抗体，标记有生物素）37℃孵育20min；PBS冲洗，加入链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）37℃孵育20min（SABC法），PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，摄片。上述一抗、二抗SABC试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。�
1.3.3 染色结果判定�
1.3.3.1 ICC染色形态判定 胞浆内有棕色或棕黄色颗粒染色为阳性着色，反之为阴性。�
1.3.3.2 ICC图像半定量分析 用IPP 5.0.1分析软件进行分析，每张盖玻片任选6个视野，在每个视野内选定阳性细胞范围，测定其平均光密度（mean optical density,MOD）。�
1.4 统计学处理�
应用SPSS 11.5统计软件包进行统计学分析，所得实验数据均以�x-±s表示，组间总体比较采用方差分析，各组间两两比较采用SNK法，以P，第二低体积分数（8%）组在1、3d及第三低体积分数(16%)组在1d外，其余各组bFGF表达均明显增加，差异有统计学意义（P0.05)，而在3、6和9d时，bFGF表达均有所下降。
3 讨 论�
DR已成为当今社会最常见的致盲性眼病之一。长期慢性高血糖作为DR的始动因素及发病基础已被大多数学者认同，但对其具体病理生理机制仍存在分歧，近年来非酶AGEs学说[3]已成为研究的热点。�
bFGF作为一种有丝分裂素，除促进细胞增殖外，还能调节细胞外基质代谢，促进胶原Ⅱ、Ⅲ的降解，且具有促进血管内皮生长因子（VEGF）表达的作用[4]。视网膜Müller细胞是一种特化的视网膜神经胶质细胞，参与视网膜多种病理过程，现在已经证实Müller细胞能分泌多种细胞生长因子，如bFGF、VEGF、胰岛素样生长因子-1、转化生长因子-β等，这些细胞因子在Müller细胞参与的视网膜多种病理过程中具有重要作用[5]。�
目前，对DR发病过程中AGEs作用的研究主要集中于血-视网膜屏障功能的损害上[6-7]，而关于其对Müller细胞的作用研究较少，鉴于Müller细胞在维持视网膜结构和功能上的重要性，我们推测AGEs对于视网膜Müller细胞的损害应该是DR发生发展的重要基础。本实验即通过研究AGEs对于视网膜Müller细胞bFGF表达的影响，而探讨Müller细胞参与DR的发病机制。�
本实验结果显示，随着干预时间延长，AGEs可以显著增加Müller细胞bFGF的表达，而随着干预浓度的增加，Müller细胞bFGF的表达也随之增加，但当AGEs达到最高浓度后，bFGF有一定的下降趋势，笔者推测这一现象可能源于Müller细胞分泌bFGF的自身反馈调节作用。�
AGEs作为糖尿病患者体内长期慢性蓄积产物，可造成多组织结构和功能的损伤。有研究报道DR患者玻璃体内AGEs含量也明显高于非DR患者[8]，这提示视网膜微环境中AGEs浓度的升高可能不仅损害了Müller细胞自身，同时可能通过促进Müller细胞bFGF的表达而间接促进了增生型糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)新生血管的形成。由此笔者认为，对于DR患者，应尽早实施玻璃体切除术，去除玻璃体内蓄积的AGEs，应能一定程度地改善视网膜局部的微环境，从而一定程度地缓解DR的进展。当然，对于AGEs上调Müller细胞表达bFGF的具体机制，尚有待进一步研究，而有关DR患者实施玻璃体切除术时机的选择，还需要临床实践予以证实。�
[参考文献]�
[1]刘瑶,陈钦元,若仓雅登,等.鼠视网膜神经细胞的原代培养[J].中华眼底病杂志,1997,13(2):116.�
[2]孙子林,刘乃丰,弓玉祥,等.糖基化终产物-牛血清白蛋白的制备和纯化[J].铁道医学,1999,27(6):361-363.�
[3]Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism[J].Diabetes,2005,54(6):1615-1625.�
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[收稿日期] 2007-09-13