【摘要】 目的 研究Survivin和Caspase-3在胃间质瘤中表达情况及临床意义。方法 用免疫组化法检测57例胃间质瘤和相应的56例光镜下阴性切缘组织及10例正常胃组织的Survivin和Caspase-3的表达情况，并进行相关的研究。结果 胃间质瘤中Survivin表达呈核型和核浆型，阳性率为75．4％，胃间质瘤的光镜下阴性切缘组织为3．6％，正常胃组织无表达; 胃间质瘤中Caspase-3表达呈浆型，阳性率为33．3％，胃间质瘤的光镜下阴性切缘组织为82．1％，正常胃组织为 80．0％。结论 Survivin在胃间质瘤中表达明显高于正常组织，与核分裂象和危险度正相关，可望作为一预后因素； Caspase-3在胃间质瘤中的表达明显低于正常组织； Survivin可能通过抑制Caspase-3的表达，从而抑制胃间质瘤的凋亡，这可能在胃间质瘤的发生发展过程中起了作用。�
【关键词】 Survivin；Caspase-3；胃间质瘤
The expression of Survivin and Caspase-3 in GST and its significance
CHEN Jin-yuan,XU Hong.
Department ofGastrointestinalSurgeon, Affiliated Hospital of GuangdongMedical College, Zhanjiang524043, China�
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of Survivin and Caspase-3 in Gastric Stromal Tumors(GST) and its significance. Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression of Survivin and Caspase-3 in 57 cases of Gastric Stromal Tumors, 56 cases of adjacent normal gastric tissues of Gastric Stromal Tumors and 10 cases of normal gastric tissues. Their relationship and significance were investigated. Results The positive rates of Survivin and Caspase-3 in Gastric Stromal Tumors were 75．4％ and 33．3％ respectively; whereas in adjacent normal gastric tissues of Gastric Stromal Tumors, the rates were 3.6％ and 82．1%respectively; and in normal gastric tissues the rates were 0 and 80.0% respectively. Conclusions The positive expression rates of Survivin in Gastric Stromal Tumors was higher than normal tissues ; the positive expression rate of Caspase-3 in Gastric Stromal Tumors was lower than normal tissues; the abnormal expression ofSurvivin and Caspase-3 in Gastric Stromal Tumors and their relationship suggested that Survivin could decrease the apoptosis of Gastric Stromal Tumors by depress the expression of Caspase-3,which may play an important role in the onset and development of Gastric Stromal Tumors. �
【Key words】 Survivin；Caspase-3；Gastric Stromal Tumors
胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）是当今肿瘤界研究的热点之一。c-kit基因突变在GIST的发生发展中的重要作用已得到公认，但是否有其他机制起作用尚值得研究。所有的GIST都是有恶变潜能的肿瘤，但所有的GIST都对常规化疗无效，其中的原因也值得探讨。�
1 材料和方法�
1．1 材料�
1．1．1 石蜡标本 收集广东医学院附属医院2002年1月至2006年10月手术切除的胃间质瘤57例(C组)及相应的光镜下阴性切缘组织56例(B组)（1例无正常切缘）的病理蜡块，另取同期因消化性溃疡行胃大部切除的正常胃组织10例(A组)的病理蜡块。胃间质瘤病例术前均未行放疗或化疗，按NIH分类法[1]，极低危险度3例，低危险度14例，中危险度19例，高危险度21例。�
1．1．2 Survivin染色试剂 ①兔抗人Survivin多克隆抗体工作液（编号 ZA-0458）。②PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒，试剂盒内容：试剂1：3%H�2O2去离子水；试剂2：Polymer Helper(即用型)；试剂3：Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG（即用型）。均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。�
1．1．3 Caspase-3染色试剂 ①鼠抗人Caspase-3多克隆抗体工作液（编号PR2285）。②即用型SABC免疫组化染色试剂盒：试剂盒内容：试剂1：5%BSA封闭液，用于组织切片的封闭。试剂2：二抗，亲和纯化抗体，标记长臂生物素，山羊抗小鼠IgG。试剂3：SABC：链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物。购自武汉博士德生物工程有限公司。�
1．2 方法
取存档的石蜡块，连续 4 μm厚度切片。采用二步法检测Survivin，SABC法检测Caspase-3,均按说明书操作。Survivin的染色用已知阳性染色的胃癌组织切片作阳性对照，结果阳性；以 PBS 代替一抗作阴性对照，结果阴性。Caspase-3染色用已知的阳性染色扁桃体组织切片作阳性对照，结果阳性；PBS 代替一抗作阴性对照，结果阴性。�
1．3 结果判断
胃间质瘤中Survivin呈核型或核浆型，阳性判断标准是：胞浆或胞核出现棕黄色颗粒；Caspase-3呈浆型，阳性判断标准是：胞浆出现棕黄色颗粒。对每张切片随机选取并计数10个高倍视野的阳性细胞百分比：阳性细胞≤10％为阴性，＞10％为阳性，并且11％～25％为弱阳性（＋），26％~50％为中等阳性（＋＋），＞50%为强阳性（＋＋＋）。�
1．4 统计学方法 以SPSS13．0进行统计学分析，以P2检验或确切概率法。�
2 结果�
2．1 Survivin在胃间质瘤中的表达情况 57例胃间质瘤中43例阳性，阴性标本中，也均有不同程度的阳性表达，只是阳性细胞百分比不到10％，56例光镜下阴性切缘组织中，2例阳性，10例正常胃组织中，均为阴性。比较Survivin在胃间质瘤、胃间质瘤阴性切缘组织和正常胃组织的表达情况结果见表1。比较Survivin在不同年龄、性别、肿瘤大小、有无肿瘤囊内出血坏死、核分裂象和危险度的胃间质瘤中的表达情况，见表2。�
2．2 Caspase-3在胃间质瘤中的表达情况 57例胃间质瘤中，19例Caspase-3阳性，56例胃间质瘤的光镜下阴性切缘组织中，46例阳性，10例正常胃组织中，8例阳性。比较在胃间质瘤、胃间质瘤的阴性切缘组织和正常胃组织的表达情况结果见表3。比较Caspase-3在不同年龄、性别、肿瘤大小、有无肿瘤囊内出血坏死、核分裂象和危险度的胃间质瘤中的表达情况，见表4。�
2．3 Survivin 和Caspase-3在胃间质瘤中的表达关系 用SPSS13．0对Survivin 和Caspase-3的阳性细胞百分比进行Spearman秩相关分析，得r＝-0．523，P=0．000，示Survivin 和Caspase-3的阳性表达呈负相关。�
3 讨论�
3．1 Survivin在胃间质瘤中的表达特点及意义 细胞凋亡是机体重要的生理过程,对维持内环境稳定具有至关重要的意义,细胞凋亡严重失衡对机体具有破坏性影响。近年来新发现的一类细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)广泛存在于许多物种中,其特殊的分子结构及抑制细胞凋亡的功能,与肿瘤的发病密切相关。�
IAP是一组高度保守的含有2~3个半胱氨酸/组氨酸的杆状病毒IAP重复序列(baculoviral IAP repeats, BIRs)的家族，能够调节脊椎动物以及果蝇的细胞凋亡。含有BIR1功能区的蛋白通过抑制有丝分裂纺锤体的延伸而阻断细胞中有丝分裂中期进入有丝分裂后期[2]。含有BIR2功能区的蛋白则具有与Caspase结合并抑制其活性的作用[3]。 Survivin是新近被克隆出的IAP分子,因其既具有与IAP其他分子的同源序列,同时又表现出独特的生物学特性,正成为肿瘤基础与临床研究领域的新热点。�
已有研究显示,绝大多数恶性肿瘤组织存在Survivin表达，不同恶性肿瘤组织Survivin表达阳性率不同,有报道认为胃癌为48．2%, 结直肠癌为63．5%,间皮瘤为100%[4-6]。�
本研究显示，Survivin在胃间质瘤有较高的阳性表达率（75．4％），与胃间质瘤的光镜下阴性切缘组织（3．57%）和正常胃组织（无表达）比较差异有统计学意义。与文献报道的在其他肿瘤中的情况基本相符，但其阳性率比胃癌高，是否提示胃间质瘤比胃癌的恶性程度更高，有待进一步研究；但从另一方面验证所有胃间质瘤都是有恶变潜能的理论。值得注意的是，本研究胃间质瘤的阴性切缘组织有2例阳性，而不论文献还是本实验都证实正常组织Survivin是阴性的，似乎可从两方面解释：①光镜下的阴性切缘组织不一定是真正的胃间质瘤阴性，如果是这样，那就提示在行胃间质瘤手术时，不要只满足于肿瘤的切除，即在不损害重要器官功能的前提下，是否应适当地扩大切除范围；②另一个解释就是胃间质瘤的发病是一个渐进的过程，该组织处于胃间质瘤前的病变阶段，也在向胃间质瘤发展，这也同样提示在临床上应适当地扩大切除范围。�
进一步比较Survivin的阳性表达与不同性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤有无坏死等临床病理因素的关系，发现差别并无统计学意义。而在危险度方面，单从阳性表达方面比较，差异无统计学意义（P＞0．05），但将极低、低、中、高危险度分别记为1、2、3、4分，与Survivin的阳性细胞百分比进行Spearman秩相关分析，得r＝0．276，P=0．038＜0．05，说明Survivin的阳性细胞百分比与胃间质瘤的危险度呈正相关。在核分裂象方面，也得到与危险度类似的结果，从阴阳性表达方面比较差异无统计学意义（P＞0．05），但将核分裂象数据与Survivin的阳性细胞百分比作Spearman秩相关分析，得r＝0．366，P=0．005＜0．05，说明Survivin的阳性细胞百分比与胃间质瘤的核分裂象成正相关。阳性细胞百分比是原始数据，更加可靠，所以应认为Survivin的阳性表达与胃间质瘤的危险度和核分裂象均有正相关。表明Survivin可作为判断肿瘤生物学特性和预后的一个参考指标。这也说明在进行统计学处理时，尽量要用原始数据，而不要作太多的转换。�
关于Survivin的细胞定位，文献报道差别较大。有研究认为[7-8]对Survivin的前体mRNA选择性剪切可产生两个不同的变异体。一个是系列中缺少外显子3的Survivin-δEX3,可表达137个氨基酸的Survivin蛋白，仍保留抗凋亡特性；另一个保留内含子2作为外显子的Survivin-2B, 表达165个氨基酸的Survivin蛋白，抗凋亡功能明显下降。两者氨基酸系列和数量的改变可导致相应蛋白质结构的变化，包括BIR结构的改变，从而具有不同的生物学效应。Survivin-2B主要定位于胞质，而Survivin-δEX3主要定位于细胞核。这些都提示Survivin的变异体在不同的亚细胞定位及不同的细胞周期发挥不同的作用。本试验中，Survivin在胃间质瘤的表达35例核型，22例呈核浆性，无浆型；而Survivin在胃癌和大肠癌阳性表达多为浆型。 Kennedy SM等[9]在研究Survivin在乳腺癌中的表达情况时认为，核型表达有较好的预后，Survivin在胃癌和大肠癌阳性表达多为浆型，是否提示胃间质瘤的预后较胃肠道癌肿好，有待进一步研究。�
Survivin正成为肿瘤靶向分子治疗的一个研究热点，虽然伊马替尼作为胃间质瘤的靶向治疗药物被广泛应用并疗效确切，但伊马替尼只能控制而不能根治胃间质瘤,仍有近一半的病例无法达到部分缓解的治疗效果[10-11]，即使有效的病例也开始发现继发耐药现象。Survivin可否作为胃间质瘤靶向治疗的一个选择点，也值得进一步研究。�
3．2 Caspase-3在胃间质瘤中的表达特点及意义 Caspase家族属于半胱氨酸基天冬氨酸基特异性蛋白酶。正常情况下，胞质内Caspase-3以无活性的酶原形式存在，只有当细胞凋亡时才被激活为有活性的Caspase-3。Caspase-3处于细胞凋亡的下游，经典的细胞凋亡途径有两条，分别是细胞外途径(细胞表面死亡受体途径)和细胞内途径(线粒体引发途径)，但最终都要通过Caspase-3的激活起作用。�
本研究发现，Caspase-3在胃间质瘤中阳性表达率（33．3％）明显低于胃间质瘤的光镜下阴性切缘组织（82．1％）和正常胃组织（80．0％），差异均有统计学意义（P 本研究发现，不同的年龄、性别、有无坏死、肿瘤大小、核分裂象和危险度的胃间质瘤中，Caspase-3的阳性表达的差异并无统计学意义，提示尽管Caspase-3在胃间质瘤中的表达受到了限制，但它不能作为判断肿瘤生物学特性的指标。其中在肿瘤有无出血坏死这一点上差异最明显，但仍无统计学意义，可能与标本量较少有关。�
3．3 Survivin 和Caspase-3在胃间质瘤中的表达关系及意义�
Survivin是凋亡抑制蛋白IAPs家族的新成员。IAPs家族蛋白发挥抗凋亡作用的机理是通过BIR功能区及两个BIR功能区之间的连接序列直接与Caspase家族蛋白结合，抑制细胞凋亡的发生[12]，多数IAPs的C末端还含有一个指状结构能够与2个锌原子形成配位键。这一锌指结构对于IAPs家族蛋白抗凋亡的功能密切相关。Survivin蛋白虽然从结构上与其它IAPs家族成员相似，但只含有一个BIR序列，而且没有C末端的锌指结构，代替这一结构的是一个包含42个氨基酸的高电荷无规则卷曲。因而对Survivin是否象其他的IAPs家族成员一样抑制Caspase家族的表达，曾经存在不同看法。�
本研究发现，在胃间质瘤中Survivin和Caspase-3的表达呈负相关（r＝－0．523，P=0．000）。提示胃间质瘤中Survivin可能通过与其他肿瘤类似的机制抑制了Caspase-3的表达，Survivin和Caspase-3共同参与了胃间质瘤的发生和发展。在本组19例Caspase-3表达阳性的肿瘤中仍有8例(42．1%)Survivin和Caspase-3的共同表达。这种结果可能与以下因素有关：①Survivin不能完全抑制Caspase-3的表达，Survivin是通过部分抑制或阻止细胞内Caspase-3的活化起抑制凋亡的作用;②抗Caspase-3抗体与活化型和非活化型Caspase-3均能结合，阳性染色可能部分由非活化型Caspase-3所致。�
参考文献
［1］ Fletcher CD, Bemen JJ, Corless C, et al. Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors, a consensus approach. Human Pathol, 2002,33(5)：459-463.�
［2］ Fraser AG, James C, Evan GI, et al. Caenorhabditis elegans inhibitor of apoptosis protein(IAP) homologue BIR-1 plays a conserved role in cytokinesis. Curr Biol, 1999,9(6):292.�
［3］ Takahashi R, Deveraux Q, Tamm I, et al. A single BIR domain of XIAP sufficient for inhibiting caspase. J Biol Chem,1998,273(14):7787-7790.�
［4］ Zhu XD, Lin GJ, Qian LP et al. Expression of survivin in human gastric carcinoma and gastric carcinoma model of rats. World J Gastroenterol. 2003,9(7): 1435- 1438 .�
［5］ Sarela AI, Macadam RC, Farmery SM, et al. Expression of the antiapoptosis gene, survivin, predicts death from recurrent colorectal carcinoma. Gut. 2000,46(5): 645-650.�
［6］ Xia C, Xu Z, Yuan X, et al. Induction of apoptosis in mesothelioma cells by antisurvivin oligonucleotides. Mol Cancer Ther, 2002,1(9):687-694.�
［7］ Mahotka C, Wenzel M, Springer E, et al. Survivin-deltaEx3 and Survivin-2B: two novel splice variants of the apoptosis inhibitor Survivin with different antiapoptotic properties. Cancer Res, 1999, 59(24): 6097-6102.�
［8］ Attieri DC. The molecular basis and potential role of Survivin in cancer diagnosis and therapy. Trends Mol Med, 2001, 7(12):542-547. �
［9］Kennedy SM, O"Driscoll L, Purcell R,et al. Prognostic importance of survivin in breast cancer. Br J Cancer. 2003;88(7):1077-1083.�
［10］ Van Oosterom AT,Judson IR, Verweij J,et al. Update of phase I study of imatinib (STI571) in advanced soft tissue sarcomas and gastrointestinal stromal tumors: a report of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group, Eur J Cancer. 2002 ,38(5): S83-587. �
［11］ Demetri GD，Von Mehren M , Blanke CD，et al. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. N Engl J Med,2002, 347 (7): 472-480.�
［12］ Duckett CS, Li F, Wang Y, et al. Human IAP-like protein regulates programmed cell death downstream of Bel-Xl and cytochromec. Mol Cell Biol, 1998, 18(1):608-615.�