【摘要】 肾活检病理是根据肾脏疾病的发病特点,在一般病理学方法的基础上,吸收了免疫病理(免疫荧光、免疫酶标),超微病理等先进手段而完成的,这些技术保证了对各类肾脏病理形态学的观察和分类的确定,治疗及其预后的估价,同时对其病因、发病机制的研究都有极大的价值。肾穿刺组织的病理检查包括HE染色、特殊染色及免疫组织化学染色(荧光法),光镜观察。�
【关键词】
肾活检;冰冻切片;免疫荧光;电镜检查
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肾小球肾炎[1](简称肾炎)是以肾小球损害为主的变态反应性炎症,是一种比较常见的疾病。临床表现主要有蛋白尿,血尿,水肿和高血压等。肾小球肾炎根据肾组织病变范围、肾小球病变情况可进行不同的分类。诊断不同,临床的治疗亦不相同,而唯一的明确分类的诊断方法就是进行肾穿刺活检。�
肾脏穿刺活检简称为肾穿[2],指应用穿刺针刺入活体的肾脏,取出少量肾组织,进行病理学分析。目前主要有2种方法,一是开放穿刺肾脏活体组织检查法,一是经皮肤穿刺肾活检法,后一种方法为国内外普遍采用的方法。经皮肾穿刺一般在B超定位下进行,一次可获取长1.0~1.5 cm,直径0.1 cm的肾组织,灰白色,在解剖显微镜下,肾小球呈针尖大小的红色点状。肾穿刺活检损伤小,获取的肾组织新鲜,不但适合常规病理检查,而且适合免疫病理学、超微病理学以及其他现代先进方法的研究,对肾脏疾病的诊断、治疗和预后判断具有无可替代的作用。肾活检组织的检查包括光镜、免疫组织化学(荧光法)和电镜观察。�
1 肾活检荧光法�
本方法是肾脏病理学中最重要的检查方法,应用恒冷切片机。冰冻切片的肾组织新鲜,抗原保存良好,因此要求组织应放在滴有生理盐水的小纱布垫上,连同纱垫置入干净的小瓶,再把小瓶放进冰桶内进行送检。冰冻切片要求于冷室内-25℃进行,厚度要求3~4 um。切片在固定液内固定后进行HE染色,并在光镜观察有无肾小球,如有肾小球,则视所备抗体的种类,切出相应数量的切片。一般检查项目有:常用羊抗人或兔抗人的免疫球蛋白(A、G、M、E)、抗γ和λ轻链,补体C3、C1q、C2、C4以及备解素。�
检查时将所需切片在室温下用冷风吹干,用pH7.4的PBS液浸泡数分钟后甩干,将荧光素标记的羊抗人IgG、IgA、IgM、C3及C1q,分别以PH7.4 0.01 mol/L的PBS液稀释30倍,滴于切片上的组织上,在37℃温箱内孵育8~10 min,再放于PBS液中洗去未与肾组织结合的抗体,取出轻度风干,并滴加缓冲甘油封片。荧光的观察结果分为6级:镜下未见免疫复合物荧光:(-);高倍下隐约可见:(±);低倍镜下隐约可见、高倍镜下可见:(+); 低倍镜下可见、高倍镜清晰可见:(++);低倍镜下清晰可见,高倍镜下耀眼:(+++);低倍镜下耀眼,高倍镜下刺眼:(++++)。�
2 肾活检光镜检查�
光镜观察是肾活检最基本的方法,要求切片要薄,一般在2 um左右,否则细胞组织重叠,导致误诊,其次为了观察分析肾小球各种细胞,免疫球蛋白的成分和沉积部位,需要进行多种特染[3],如显示基底膜的PAS、PASM,显示免疫复合物的Masson等,另外还要根据不同的病例,添加相应的染色和免疫组织化学方法,如刚果红等。�
苏木素-伊红(HE)染色法:切片常规脱蜡[4]入水,用Harris苏木素染色7 min,自来水充分冲洗,再用1%盐酸酒精分化数秒钟,1%氨水返蓝后,入1%伊红染色3 min,最后用梯度酒精进行脱水,二甲苯透明,树胶封片。其染色结果呈现细胞核紫蓝色,细胞浆、基底膜、胶原纤维粉红色。�
PAS染色法:切片常规脱蜡入水后,用1%过碘酸液氧化5~10 min,蒸馏水充分进行冲洗,接着入Schiff液染色10~20 min(温度最好保持在37℃左右),取出后自来水进行充分冲洗,再进行Harris苏木素1 min淡染,自来水洗涤,1%盐酸酒精分化,1%氨水返蓝,最后脱水、透明、封固。其检查结果为细胞核蓝色,基底膜、肾小球系膜基质、胶原纤维及细胞浆均呈红色。�
过碘酸六胺银(PASM)染色:切片常规脱蜡入水,用1%过碘酸液氧化5~10 min,蒸馏水充分进行冲洗,再用5%铬酸水溶液氧化40 min,取出并擦去片子上多余铬酸水溶液,浸入1%亚硫酸钠水溶液去除铬酸1 min,再用蒸馏水充分冲洗,接着浸入六胺银工作液20~30 min(温度要求在60℃左右),切片呈深棕色时取出,蒸馏水充分冲洗后用0.2%氯化金水溶液调色1 min,5%硫代硫酸钠1 min,蒸馏水稍洗,再用Harris苏木素淡染1 min,1%盐酸酒精分化,1%氨水返蓝,最后进行梯度酒精脱水、透明、封固。该检查结果为基底膜、网状纤维呈现黑色,细胞核紫蓝色(如用苏木素进行淡染后,还进行伊红染色的,细胞浆呈粉红色),主要藉以观察肾小球及底膜病变,如基底膜增厚,双层以及钉突形成等,是肾活检中最主要的染色技术之一。�
刚果红染色:切片常规脱蜡入水后,加甲醇刚果红液染色10 min,吸去甲醇刚果红液,加碱性酒精迅速分化,镜下控制至背景清晰后流水冲洗5 min,再加Mayer`s苏木素染色2-5 min,流水冲洗15 min,最后进行常规脱水透明,中性树胶封片。其检查结果为淀粉样蛋白呈橙红色,细胞核蓝色。(在偏光镜下可观察到淀粉样蛋白呈绿色双折光)。�
3 肾病理活检的意义�
许多临床分型方法不能明确诊断,在判断预后等方面存在很多不足,而采用肾活检有利于明确诊断、指导治疗、判断预后、探讨临床分型与病理分型的关系,也是提高肾脏病临床与科研水平的重要手段之一,应用肾穿刺活检可以明确诊断,肾活检与尸检的诊断符合率高达84%。特别是由于近年来电镜与免疫病理学的飞速发展,大大促进了肾脏病的诊断水平。�
目前肾脏病的诊断方法基本上有3种,一是临床诊断,二是病理诊断,三是免疫病理诊断,后两种诊断常结合应用,必须依靠肾穿刺活检,而诊断最有意义。例如,临床上表现为原发性Ⅱ型肾病综合征[5],病理上却可见于多种病变类型,如中至重度系膜增殖性肾炎、IgA肾病、膜增殖性肾炎、局灶节段肾小球硬化等,所以最后确诊应依靠病理与免疫病理诊断。而且许多容易漏诊的病变,只有依靠肾活体组织检查才能确诊,如间质性肾炎、IgA肾病、IgM肾病等。�
其次,通过肾穿刺活检明确诊断后,可为临床制定治疗方案、修正治疗方案,提供重要的依据。再以原发性肾病综合征为例,若肾穿刺活检诊断为微小病变型,则应用激素治疗效果良好,Ⅱ型肾病综合征根据病理类型不同,对激素治疗的反应性也不同,某些病理类型加用细胞毒性药物后,反而取得了良好的效果。在急性肾脏病,尤其急进性肾炎,肾穿刺活检是确诊的指标。当肾穿刺活检明确诊断后,就可以采用大剂量激素冲击疗法,对抢救急危重症,具有重要意义。�
在判断预后方面,肾穿刺活检明确诊断后,基本上可以估计病变的预后,临床上诊断为同一类型的肾炎,病理上则有不同的表现,其预后也不尽相同。�
此外,由于肾穿刺活体组织检查法的开展,也为我们探讨肾脏病临床与病理的关系提供了方便,尽管目前尚无可靠的结论,但对于该领域的深化研究以及探讨肾脏病发病机制,推动肾脏病临床和科研的深入开展、肾脏病学的发展,具有重要的作用。�
参 考 文 献�
[1] 邹万忠,等.肾脏病理与临床.湖南科学技术出版社,1997:7.�
[2] 黎磊石,等.肾活检诊断.南京军区总医院学报,1984.�
[3] 龚志锦,等.病理组织制片和染色技术.上海科学技术出版社,1994:359.�
[4] 郑燕璇,王晓鸿,苟新敏.石蜡切片脱蜡方式的比较.中国实用医药,2009:211.�
[5] 刘梦海,李伯祥.200例肾小球疾病的病理与临床分析.中华肾脏病杂志,1991,3:202.