［摘要］ 目的 结合ZAP-70、CD38探讨免疫表型在B慢性淋巴细胞白血病（B-CLL）诊断和预后评价中的应用价值。方法采用多参数流式细胞术检测45例B-CLL患者CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、FMC7、CD38及ZAP-70 的表达。结果45例B-CLL均高表达CD19、CD20，其中有43例（95.6%）表达CD5,42例（93.3%）表达CD23，30例表达CD22（66.7%），无一例表达FMC7和CD10。将所有病例分为两组，ZAP-70�+CD38�+ /ZAP-70�-CD38�-组占84.4%（38/45）,ZAP-70�+CD38�-/ZAP-70�-CD38�+占15.6%（7/45），两组所占比例差异有统计学意义（P1,CHEN Bao-an1,LI Jian-yong2，XU Wei2，YANG Hui2，
(1.Department of Hematology,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China;
2.Department of �Hematology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)��
Abstract:Objective To investigate the characteristics of immunophenotype of B chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) and to evaluate the value of ZAP-70 and CD38 in diagnosis and prognosis of B-CLL.Methods The expression of CD5，CD10，CD19，CD20，CD22，CD23，FMC7,CD38 and ZAP-70 of 45 B-CLL patients were determined by four-color flow cytometry(FCM).Results Forty-five B-CLL patients were all over-expression of CD19 and CD20,among them,CD5,CD23,CD22 were expressed in 43,42,30 patients respectively,no case was seen expression of FMC7 and CD10.All the cases were divided into two groups,84.4%(38/45) was in ZAP-70�+CD38�+ /ZAP-70�-CD38�-group,15.6%(7/45) was in ZAP-70�+CD38�-/ZAP-70�-CD38�+group.There was significant difference betweenthe ratio of the two groups(P[1]（表1）,典型CLL积分4~5分。��
1.2 试剂与仪器�
膜单克隆抗体包括CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、FMC7、CD38及胞浆单抗ZAP-70。除ZAP-70及其同型对照为美国Caltag产品（clone 1E7.2）外，其余单抗均为法国Immunotech公司产品。流式细胞仪为Beckman-Coulter公司的Epics XL 型（USA），488nm激发波长，采用Expo32-ADC分析软件。�
1.3 常规免疫表型检测�
新鲜抽取的肝素抗凝骨髓或外周血(6h内),调整细胞数至（0.5~1）×106个・mL-1，采用三色或四色流式分析方案检测胞膜抗原。每管取100μl样本加不同组合抗体各20μl，同时做同型对照管，混匀，避光20min，溶血后上机检测分析，每管获取10000个细胞，抗原表达在淋巴细胞中≥30%为阳性。�
1.4 ZAP-70蛋白检测�
取100μl骨髓或外周血,加CD5-FITC、CD19-PC5各20μl，避光15min,加Fix&Perm试剂盒A固定液100μl，避光 15min，加PBS2ml，1000r・min-1离心5min，弃上清，轻振细胞后各管加100μlB破膜剂,5min后加ZAP-705μl，避光15min，加PBS2ml，1000r・min-1离心5min，弃上清，1.5mlPBS重悬，上机检测至少10000个细胞，同时做同型对照管。ZAP-70检测流程是利用正常T淋巴细胞广泛表达ZAP-70，在CD5和CD19双参数图上将提取CD5单阳细胞置于CD5、ZAP-70双参数图上，作为ZAP-70活性的阳性控制，再提取CD5、CD19双阳性细胞（B-CLL细胞）并分析ZAP-70的表达率，ZAP-70≥20%为阳性[2]。�
2 结果�
2.1 常规免疫表型结果�
45例B-CLL均高表达CD19、CD20，其中有43例（95.6%）表达CD5,42例（93.3%）表达CD23，30例表达CD22（66.7%），无一例表达FMC7和CD10。�
2.2 ZAP-70及CD38在B-CLL中的表达�
45例B-CLL中有3例(6.7%) 单纯ZAP-70�+，4例(8.9%)单纯CD38�+，24例(53.3%) ZAP-70�-CD38�-，14例(31.1%) ZAP-70�+CD38�+。将所有病例分为两组，ZAP-70�+ CD38�+/ZAP-70�-CD38�-组占84.4%（38/45）,ZAP-70�+CD38�-/ZAP-70�-CD38�+组占15.6%（7/45），两组比例差异有统计学意义（P[1]，其主要的表型特点是CD5阳性的B细胞，即CD19�+CD5�+，同时伴CD23�+、CD20�+，弱表达CD22，不表达FMC7。本组有40例(88.9%)符合这一诊断标准,另有2例患者(4.4%)不表达CD5，3例患者(6.7%)不表达CD23，但此5例患者无一例出现CD5和CD23双阴性，结合细胞形态学、遗传学及临床表现进一步诊断为不典型B-CLL。尽管文献报道CLL中CD22的表达多为阴性，但在我们的检测结果中，有66.7%的患者表达CD22，和刘艳荣等[2]报道的结果较为一致，认为与抗体荧光素的选择相关。值得一提的是，在对B-CLL免疫表型分析时，我们建议应先以FSvsSS设门取淋巴细胞群，再行二次设门取CD5、CD19双阳性细胞后分析其余抗原表达，对于少数CD5�-B-CLL患者应设门取CD23、CD19双阳性细胞后再进一步分析其余抗原表达，以确保所测得的抗原表达为肿瘤细胞的准确结果。�
已知CLL预后相关因素甚多[3],ZAP-70在B-CLL中的表达及预后价值近期受到关注，ZAP-70是一种与TCRζ相联系的相对分子质量为70000的蛋白酪氨酸激酶（PTK），广泛表达在T细胞和NK细胞中，在TCR受刺激后出现可诱导的双磷酸化而激活T细胞信号传导通路。部分B-CLL的肿瘤细胞处于细胞周期的G�0期，BCR水平低于正常B细胞，而ZAP-70在Syk缺陷的B-CLL中，能代替Syk重新构建BCR信号传导通路，从而高表达 ZAP-70，认为其可替代IgVH基因突变作为CLL最有效的预后指标[4]。CD38是一种能促使B细胞活化和增殖的Ⅱ类跨膜糖蛋白，它与CLL预后的相关性争论颇多[5-6]，有研究[7] 认为CD38随着病情的进展会发生相应变化，CD38这种改变在临床上使其可以作为CLL病情进展的一个指标。我们采用流式细胞术在常规免疫分型基础上，检测ZAP-70和CD38在B-CLL中的表达，有84.4%患者ZAP-70�+CD38�+ 或ZAP-70�-CD38�-，说明ZAP-70和CD38的表达存在相关性（P[8]报道CD23�-提示预后不良，本组有3例患者不表达CD23，结合另两个预后相关指标ZAP-70、CD38，发现这3例患者ZAP-70和CD38均为阴性，但临床进展缓慢，此三者与预后的关系将有待大样本检测进一步明确。免疫分型对于明确细胞起源、划分分化发育阶段及对B-CLL的诊断有重要意义，实际诊断时应结合形态学、细胞及分子遗传学、分子生物学结果，这些指标为临床诊断及治疗提供准确快速的依据。 �
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[收稿日期] 2006-09-02