摘要：目的：探讨体外三磷酸腺苷生物荧光法化疗药物敏感试验(ATP-TCA)在肝癌化疗中的应用价值。方法：用ATP．TCA法检测6种化疗药物对37例肝细胞癌标本的敏感率和耐药率。结果：37例肝癌标本中，ATP-TAC的可评估率为89.19％，6种化疗药物的敏感率分别为：更生霉素(ACTD)84.85％；长春瑞滨(NVB)78.79％；丝裂霉素C(MMC)75.76％羟基喜树碱(HCT)42.42％；长春新碱(VCR)39.39％；吡柔比星(THP)36.36％。各试验药物的敏感率与肿瘤的大小、血清甲胎蛋白(AFP)无显著相关性(P>0.05)，ACTD在P53蛋白阴性时敏感性较好，而ACTD、HCT、THP对I、I级肝癌的敏感率高于I、Ⅳ级。结论：ATP-TCA法在检测肝癌化疗药物敏感性时稳定可靠，可作为肝癌化疗药物筛选的方法之一。
关键词：肝细胞癌；化疗药物敏感试验；三磷酸腺苷生物荧光试验
中图分类号：R735．7
文献标识码：A
文章编号：1008－2409(2007)03－0430－03
传统化疗药物的长期使用使耐药现象越来越普遍，同一组织类型的肿瘤对同一药物的敏感性存在较大差异以及肿瘤多药耐药基因的普遍存在，这些因素都会影响肿瘤的化疗效果，肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)经验性联合化疗方案临床有效率低于30％。三磷酸腺苷生物荧光试验(ATP－base bioluminescence tumor chemosensitivity assay，ATP－TCA)是近几年发展起来的检测体外化疗药物敏感性的新方法，对恶性实体瘤有较高可评估率。本研究采用ATP－TCA检测临床上常用的化疗药物对肝癌组织的敏感性，为临床化疗方案的选择提供理论依据。
1 资料与方法
1．1一般资料
2004年1月至2005年3月广西医科大学第一附属医院肝胆外科手术切除的肝癌标本37例，其中男34例，女3例；平均46.4岁。全部病例均通过病理证实为肝细胞癌。其中伴有不同程度的肝硬化33例；HBsAg(+)35例，HBsAg(－)2例；AFP阳性23例(62.16％)，阴性14例(37.88％)；有门静脉癌栓10例；包膜完整9例；15例肿瘤直径小于5cm(40．54％)，22例直径大于5cm(59.46％)；病理分级：I级5例，I级17例，噩级10例，Ⅳ级5例。P53阳性19例，阴性18例。
1．2材料
ATP－TCA试剂盒：完全分析培养剂(CAM)、肿瘤组织解离酶、红细胞裂解液、最大ATP抑制剂、肿瘤细胞ATP提取液、荧光一荧光素酶、96孔无菌微孔培养板、注射器、过滤器等均为北京金紫晶公司的产品。MPL1自发光分析仪为德国BERTHOLD公司产品。
1．3方法
取新鲜肝癌组织约10g，切碎，用DNA酶、I型胶原酶等组成的混合酶分解癌组织，在37℃，5％CO2，95％湿度下孵育2～4h后，制成细胞悬液。倒置显微镜下，观察细胞的活性，进行细胞计数达到(1.5～2.5)×105个／mm3时备用。以CAM为溶剂将化疗药物配制成800％浓度备用，然后在96孔板上倍比稀释至6个梯度药物浓度：200％，100％，50％，25％，12.5％，6.25％，设置空白对照、ATP最大抑制对照，每孔各加入0.1ml细胞悬液，于5％C020.37℃，大于95％湿度下孵育6～7d，再加入ATP提取液0.1ml混匀后置室温下20～30min，取0.05ml混合液于检测板，加入荧光素一荧光素酶复合物0.05ml，发光分析仪检测。根据化疗药物系列浓度对培养肿瘤的细胞的不同抑制率，获得化疗药物的剂量－抑制曲线。从不同药物的剂量所对应的抑制率，取得化疗药物的剂量－抑制曲线下面积、抑制半数肿瘤生长时的药物浓度(IC50)、抑制90％肿瘤生长时的药物浓度(IC90)等参数，进而判断该肿瘤细胞对化疗药物的敏感度程度。
1．4敏感度分级
参考Kurbacher等人的标准[妇(TDC为测试药物溶度)。
强敏感：IC90≤100％TDC和IC50≤25％TDC。
部分敏感：IC90＞100％TDC和IC50≤25％TDC。
弱敏感：IC90≤100％TDC和IC50＞25％TDC。
耐药：IC90＞100％TDC和IC50＞25％TDC。
1．5统计学处理
SPSS11.0 for windows四格表确切概率法。
2 结 果
2．1 12种药物的敏感率
37例肝癌标本中有4例未培养出足够的活细胞数，未能继续进行试验。6种药物的敏感结果见表1，结果显示更生霉素的敏感率最高，丝裂霉素、长春瑞滨也有较高的敏感率，长春新碱、吡柔比星及羟基喜树碱的敏感率不足50％。
2．2药物敏感性与血清甲胎蛋白(AFP)、肝癌大小及P53蛋白的关系
6种药物的敏感率与AFP阳性率及肿瘤大小之间无相关性(P>0.05)；更生霉素在P53阴性时较敏感，其他药物的敏感率与P53不存在相关性(表2)。
2．3药物敏感性与肝癌病理分级的关系
本研究结果显示羟基喜树碱、更生霉素、吡柔比星3种化疗药物对病理I、I级的病例，其敏感率高于Ⅲ、Ⅳ级，有显著性差异(P4即可。四氮唑蓝快速比色法(MTT)是目前较常用的体外肿瘤药敏试验方法，广泛应用于细胞系的体外药物敏感试验。Petty等通过ATP－TCA与MTT法比较试验得出，ATP-TCA法所需细胞数最低可达1563个／孔，而MTT为25000个／孔。③干扰因素少。ATP－TCA法中的完全培养液(CAM)能抑制纤维细胞、血细胞的生长，减少干扰。④检测效率高，可同时动态检测评估6个化疗药物剂量。⑤稳定性好，ATP降解慢，具有较好稳定性，有试验表明ATP-TCA法的变异系数为1.2％～15.8％。⑥周期短，只需1个星期左右可得到检测结果，比较适合临床实际应用。
本研究组37例标本，有4例培养不成功，可评估率为89.19％，较国内一些报道低，与国外一些参考文献较为一致。细胞培养不成功的病例均为巨块型肝癌，可能与巨块型肝癌中心发生缺血坏死、取材不良、难以培养出足够的活细胞数有关。
更生霉素、丝裂霉素C、吡柔比星均为细胞周期非特异性药物，丝裂霉素C、更生霉素主要杀灭增殖期和G0期细胞，而吡柔比星可以在G2期使细胞无法进行分裂，导致肿瘤细胞死亡，有学者认为肝癌的大多数细胞是G0期细胞，这可能是更生霉素、丝裂霉素c的敏感率明显高于吡柔比星的原因之一，国内一些学者的研究也表明了丝裂霉素C对肝癌有较高的敏感率，提示抗生素类抗肿瘤药物运用于肝癌的治疗可获得较好的疗效。长春瑞滨可以与微管蛋白结合，使细胞在有丝分裂过程中微管形成障碍，研究显示长春瑞滨的敏感率(78.79％)高于作用机制近似的长春新碱，因此，今后肝癌的化疗中选用长春瑞滨可能会有一定的疗效。
羟基喜树碱、吡柔比星是肝癌化疗方案中较常采用的药物之一，两者的敏感率较低，而且对细胞本试验表明药物敏感性与临床上常采用的AFP、P53、肿瘤大小等指标无相关性，不同的患者的药敏结果相差甚远，这与临床实际化疗的效果是一致的，说明肝癌患者的化疗应根据药敏结果进行。但体外药物敏感试验的结果并不能完全说明药物在体内的作用情况，本研究只为临床药物的选择提供了参考依据，其与临床的相关性有待进一步的研究。ATP-TCA药物敏感试验有可能改变传统的肿瘤化疗模式，依据药敏结果对患者实施个体化、动态化的化疗可能成为一种趋势。
[责任编辑 王慧瑾 邓德灵]