[摘要]目的 探讨曲拉通法联合丹参酚酸B处理对猪心脏瓣膜形态学及生物力学的影响，为组织工程提供理论支持。方法 新鲜的猪主动脉瓣叶，采用两种不同方法脱细胞处理，应用光镜、电镜进行形态学观察，厚度仪测量组织厚度，行拉力测试观察生物力学的差异。结果 两种方法处理后组织厚度差异无统计学意义（P＞0.05），曲拉通-丹参酚酸B法较好地保留心脏瓣膜原有的三维空间，且生物力学测试优于传统曲拉通法（P＜0.05）。结论 曲拉通联合丹参酚酸B处理可以制备基质成分保留充分、生物力学性能优良的心脏瓣膜支架，显示了可观的临床应用前景。
[关键词] 丹参酚酸B；后处理；组织工程；心脏瓣膜；形态学；生物力学
[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号]1673-9701（2011）22-13- 02
Effect of Salviaolic Acid B Postconditioning on Morphology and Biomechanics in Decellularized Porcine Aortic Valve
TAO Rancen GUO Guangwei
Department of Cardiothorocic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
[Abstract] Objective To observe the effect of salviaolic acid B postconditioning on morphology and biomechanics of decellularized pocine aortic valve，providing theoretical support for tissue engineering. Methods Porcine aortic valve leaflets were theated by two different proticols. Control group1 involved treatment with Triton-x100，sodium deoxycholate，DNase and RNase. And group 2 were treated by Triton-x100，sodium deoxycholate，DNase and RNase， then using salviaolic acid B post-processing. Eath samples were observered by microscopy and scanning electron microscope； Biomechanics characteristics measured by biomechanics properties-maximum deflection，elongation rate and max tensile stress. Statistical analysis was performed to compare the thickness. Results There was no significant difference in tissue thickness was found between two methods，Tx-sal method can protect the heart valve three-dimensional structure，biomechanics properties-maximum deflection ， max load and elongation rate were increased significantly in the group with salviaolic acid B. Conclusion Salviaolic acid B post-processing can effectively protect the collagen and elastic fibers and improve the biomechanical properties of decellularized pocine aortic valve.
[Key words] Salviaolic acid B； Postconditioning；Tissue engineering；Heart valves； Morphology；Biomechanics
理想的组织工程异种生物瓣膜支架应彻底去除细胞成分、最大限度地保存弹性纤维和胶原纤维，才能最大程度地减低免疫原性，较好地保留细胞黏附所需的三维微环境，进而更好地避免在瓣膜置换术后瓣膜的钙化和腐败，提高瓣膜耐久性[1-2]。目前，国内外所采用的酶或/和去垢剂脱细胞猪心脏瓣膜仍存在血栓形成、力学和免疫反应等方面的问题。因此本研究通过建立传统的曲拉通法脱细胞模型、应用丹参酚酸B后处理的方法，比较两组瓣膜形态学及生物力学性能的差别，探讨其在组织工程心脏瓣膜（TEHV）的应用前景。
1 材料与方法
1.1 实验材料
猪心购自太原屠宰场，选取6～7月龄的猪宰杀后取出心脏，PBS液冲洗后，放入无菌袋中立即运回实验室，在处死１h内取主动脉瓣膜。
1.2 药品、试剂和仪器
丹参酚酸B（四川广汉市本草植化有限公司）、脱氧胆酸钠、Triton-x100、EDTA、核糖核酸酶（RNaseⅠ）和脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）购自美国Sigma公司；水浴恒温震荡仪，Olympus双目显微镜，扫描电子显微镜（H-8000），HD-10型厚度仪（中国郑州），拉力试验机（Instron Company，SE08-292，USA）。
1.3 实验分组及试验方法
按随机数字法，将120片瓣叶随机分为三组：曲拉通组、曲拉通-丹参酚酸B组和正常组（新鲜猪主动脉瓣叶）。每组40片，曲拉通-丹参酚酸B作为实验组，曲拉通和正常组作为对照。
①曲拉通（Triton-x100，Tx）组[3]：消毒处理好的瓣叶，PBS液反复冲洗后置入含0.25%的脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）、0.25%Triton-x100、0.02%的DNA酶、RNA酶和EDTA溶液恒温37℃持续震荡48h，用PBS液洗涤至清澈，后在4℃Hanks液中保存。②曲拉通-丹参酚酸B（Triton-x100 +salvianolic-acid B，Tx-sal）组：消毒处理好的瓣叶，PBS液反复冲洗后置入含0.25%的脱氧胆酸钠、0.25%Triton-x100、0.02%的DNA酶、RNA酶和EDTA溶液恒温37℃持续震荡48h，后置于0.5%的丹参酚酸B溶液中4℃恒温震荡48h，用PBS液洗涤至清澈，后在4℃Hanks液中保存。
1.4 观察指标
1.4.1 光学显微镜和电子显微镜观察 取各组瓣叶，常规4%甲醛固定，石蜡包埋，切片，从各组取5张石蜡切片， 二甲苯脱蜡，HE染色、Masson染色，光学显微镜下观察。分别观察脱细胞程度、两组对胶原纤维的影响。两组各取5片瓣叶，用3%戊二醛预固定，用1%的四氧化锇再固定，乙醇梯度脱水，离子溅射喷金，扫描电镜观察。
1.4.2 组织厚度 每组各取10片瓣叶，分别应用 HD-10型厚度仪测量瓣膜组织厚度。
1.4.3 生物力学特性 用拉力试验机（Instron Company，SE08-292，USA）将瓣叶沿瓣膜长轴进行拉伸实验，标距为20mm，以10 mm/ min速度牵拉瓣叶至断裂，计算拉伸强度、最大变形量、断裂伸长比。
1.5 统计学处理
所有数据以均数±标准差（χ±s）表示，应用SPSS16.0统计软件。组间差异性判断应用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 标本观察结果
新鲜组瓣叶呈淡红色，基本保持正常形态结构。经曲拉通脱细胞处理后瓣叶呈白色半透明，实验组经丹参酚酸B处理后瓣叶为乳白色。三组瓣叶均柔软，富有弹性。
2.2 光镜观察结果
HE染色显示，正常组可见大量间质细胞和蓝染的内皮细胞核，瓣膜结构紧密，Tx组和Tx-sal组脱细胞较完全，内皮细胞无残留，见封三图1、2、3。Masson染色显示，正常组胶原纤维排列整齐、无断裂现象。Tx组胶原纤维结构改变明显，纤维走向模糊，排列松散，波浪状结构消失；Tx-sal组胶原纤维三维网状结构完整存在，波浪状规则排列，纤维走向自然清晰，见封三图4、5、6。
2.3 电镜观察结果
扫描电镜显示两组去细胞瓣膜内皮细胞、间质细胞清除彻底，无残留。Tx组可见瓣膜支架结构明显改变，胶原纤维轻度断裂，形成深浅不一的沟。相比之下，Tx-sal组瓣膜三维网状结构规则、清晰，超微结构改变不明显。
2.4 组织厚度
组织厚度Tx组与加Tx-sal组分别为（0.73±0.03）mm和（0.75±0.05）mm，差异无统计学意义（P＞0.05 ）。
2.5 生物力学性能测定
Tx-sal组心脏瓣膜的抗拉强度、最大变形量、断裂伸长比明显高于Tx组（P＜0.05）。见表1。
表1 各组生物力学性能测定结果（χ±s， n=10）
组别 抗拉强度（MPa） 最大变形量（mm） 断裂伸长比（λ）
正常组 2.32±0.34 7.89±0.24 1.66±0.33
Tx组 2.21±0.37 8.15±0.77 1.25±0.18
3 讨论
近年来，随着组织工程学科的发展，组织工程心脏瓣膜（TEHV）能更好地解决人工瓣膜置换术后诸多的并发症，已成为目前瓣膜领域研究的热点[4，5]。理想的去细胞方法要求完全去除瓣膜细胞，降低免疫原性，又能保留天然瓣膜的胶原纤维、弹力纤维等细胞外基质成分，保持足够的机械强度以满足心脏瓣膜的功能需求[6，7]。Bodnar[8]用Triton-x100和脱氧胆酸钠去细胞法处理瓣膜较为理想，细胞去除彻底，血液相容性好，是两种良好的组织工程瓣膜支架的制作方法。但是两者都存在钙化和衰败以及黏附较为困难的问题。有研究表明[9]，机械应力变化是直接引起异种生物瓣膜腐败的重要因素之一，且承受应力大的部位也最容易发生钙化，长期的机械应力不仅导致瓣膜胶原纤维机械性损毁，还可使瓣膜变形产生间隙，大量的离子和血浆进入组织间隙聚集引起血栓发生，导致瓣膜衰败。因此，研究如何提高支架机械性能、减低移植物免疫原性、减少瓣叶钙化，具有重要临床意义。
丹参酚酸B（Salviaolic acid B）是丹参提取物的重要组成成分，为一种缩酚酸多羟基化合物，由一分子咖啡酸与三分子丹参素缩合而成，分子式C36H30O16。大量研究表明，salB能捕捉超氧阴离子；清除氧自由基；减低内皮细胞间黏附因子（ICAM-1）的表达，减少白细胞浸润；还可避免细胞内的钙超载，降低钙化[10]。本研究结果显示，经丹参酚酸B改性处理脱细胞猪心脏瓣膜的弹性纤维、胶原纤维等细胞外基质的三维网状结构明显优于传统的曲拉通法，此外，拉力力学检测结果表明，实验组脱细胞猪心脏瓣膜抗拉强度、最大变形量、断裂伸长比明显高于对照组，显示了优良机械性能，提高瓣膜抗疲劳性，有助于延长置换术后瓣膜的使用寿命。
综上所述，经丹参酚酸B后处理的心脏瓣膜内皮细胞去除彻底，胶原纤维保存完整，机械性能较为稳定，是制备组织工程心脏瓣膜支架的优良方法，并显示可观的临床应用前景。
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（收稿日期：2011-06-21）