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猪肉瘦肉精的检测3篇
【篇1】猪肉瘦肉精的检测
/br>测定猪肉食品中8种β-受体激动剂孟 娟, 石 莹, 张 晶, 邵 兵*(北京疾病预防控制中心, 食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室, 北京 1000013)
摘 要: 目的 采用超高压液相色谱-电喷雾串连四极杆质谱同时测定猪肉食品中8种β-受体激动剂残留。方法 试样中β-受体激动剂残留经酶解后超声提取, 低温离心后, 上清液用MCX固相萃取柱净化, Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱分离, 以甲醇0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱, 最后用液相色谱-质谱/质谱进行测定。结果 该方法的平均回收率为75.6~118.7%, 相对标准偏差小于25.0%, 方法的定量限为0.1~0.2 μg/kg。结论 该方法操作简单, 灵敏度高, 重现性良好, 适用于猪肉食品中β-受体激动剂残留的定性与定量检测。
关键词: 超高压液相色谱-串联质谱法; 固相萃取; β-受体激动剂; 食品安全; 兽药残留
Simultaneous determination of eight β-agonists residues in animal food by ultra pressure liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry
MENG Juan, SHI Ying, ZHANG Jing, SHAO Bing
(Beijing Key Laboratory of Diagnostic and Traceability Technologies for Food Poisoning, Beijing Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China)
ABSTRACT: Objective To develop an analytical method for the determination of eight kinds of β-agonists in animal producing food based on ultra pressure liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Methods Samples were enzymatic hydrolysed and extracted by acetic acid buffer (pH 5.2) and then purified and enriched by Oasis MCX solid phase extraction cartridges. The separation was performed on a Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 column (100 mm×2.1 mm i.d., 1.7 μm) with gradient elution using methanol and water containing 0.1% formic acid at a flow rate of 0.3 mL/min. Results Average recoveries of this method for fortified samples ranged from 75.6% to 118.7% with relative standard deviations less than 25.0%. The limits of quantitation (LOQ) for the whole method ranged from 0.1 μg/kg to 0.2 μg/kg. Conclusion Due to its high sensitivity and reproducibility, the method is suitable for the determination of agnoists in animal producing samples.
KEY WORDS: Ultra pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); solid- phase extraction; β-agonists; food safety; veterinary drugs residue
兽药残留问题是影响动物性食品安全的主要因素[1]。在诸多兽药中, β-受体激动剂因较强的毒性及易被滥用等特点一直受到广泛关注。这类药物作用效应较强, 在动物体内残留时间较长, 短期内产生残留量较大, 可通过食物链进入人体, 会使一些易感人群产生较明显的中毒症状甚至死亡, 严重危害人类健康。我国政府早在十余年前就将β-受体激动剂列入“食用动物禁用兽药清单”[2,3], 但是在利益驱使下, β-受体激动剂的滥用问题依然严重, 其中影响最大的是2011年的双汇瘦肉精事件。
现阶段, 动物性食品中β-受体激动剂一直是我国兽药残留监测工作的重点。目前的分析方法包括免疫测定法、气相色谱-质谱法、高压液相色谱法和液质联用分析法等[4-8]。其中液相色谱-质谱法特异性强、灵敏度高, 是β-受体激动剂残留检测的最主要的技术手段[9-11], 但样品处理程序都较为复杂, 费时费力。本文在已有方法的基础上, 简化了样品前处理步骤, 采用MCX 柱固相萃取和超高压液相色谱-串联四级杆质谱技术建立了猪肉、猪肝和猪肾中8种β-受体激动剂同时检测方法。
1 材料与方法1.1 仪器与试剂ACQUITYTM 超高压液相色谱仪(Waters公司); Micromass®-Quattro Premier XE质谱仪(Waters公司); X-22R型冷冻离心机(德国Beckman公司); 漩涡混合器; NVEP-116型氮吹仪。
Oasis MCX 固相萃取(SPE)小柱(6 mL, 150 mg, Waters公司)。
氨水、乙酸、乙酸钠均为分析纯(国药集团北京化学试剂公司; 甲醇(色谱纯, 美国Fisher公司); 甲酸(纯度为99%, Ameisensaeure); β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶(德国罗氏公司); 实验用水均为超纯水。
8种β-受体激动剂: 妥布特罗(tulobuterol, CAS: 41570-61-0)、特布它林(terbutaline, CAS: 23031-25- 6)、沙丁胺醇(salbutamol, CAS: 51022-70-9)、非诺特罗(fenoterol, CAS: 1944-12-3)、福莫特罗(formoterol, CAS: 73573-87-2)、克伦特罗(clenbuterol, CAS: 37148- 27-9: )、莱克多巴胺(ractopamine, CAS: 97825-25-7)、异丙喘宁(metaproterenol, CAS: 586-06-1)购自Sigma或Dr,E公司, 纯度均大于等于99%。
标准储备溶液的配制: 准确称取克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、非诺特罗、福莫特罗、莱克多巴胺、异丙喘宁各10 mg (精确至0.1 mg), 分别用甲醇溶解并定容至10 mL, 浓度为1000 mg/L, 18 ℃冰箱中保存, 有效期12个月。临用前用10%甲醇水溶液将标准储备溶液配制为0.5~100.0 μg/L的标准工作液。
1.2 检测条件色谱条件 色谱柱: ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 柱温: 40 ℃; 进样体积: 10 μL; 流动相A为含0.1%甲酸的水溶液, 流动相B为甲醇; 流速为0.3 mL/min; 流动相线性梯度洗脱: 0~3 min, 95%~80%A; 3~10 min, 80%A~50%A; 10~10.1 min, 50%A~1%A; 10.1~12 min, 1%A~1%A; 12~12 .1 min, 1%A~95%。
质谱条件 电喷雾电离正离子模式(ESI+); 质谱扫描方式: 多反应监测(MRM); 毛细管电压: 3.3 kV; 源温度: 100 ℃; 脱溶剂气温度: 350 ℃; 脱溶剂气流量: 600 L/h电子倍增电压: 650 V; 碰撞室压力: 3.1×10-3 mbar。
8种β-受体激动剂的质谱采集参数见表1。
1.3 样品前处理加标用空白猪肉、猪肝和猪肾样品获赠于中国农业大学动物医学院。准确称取5.0 g(精确到0.01 g)匀浆样品, 加入10 mL pH 5.2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中, 10000 r/min匀浆1 min, 再加入β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液100 µL, 于37 ℃±1 ℃振荡酶解过夜。取出后超声振荡15 min。放入冷冻离心机中, 4 ℃ 10000 r/min离心10 min。倾出上清液, 残渣再用10 mL pH 5.2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液提取一次, 10000 r/min离心10 min。合并上清液。MCX柱用6 mL甲醇、6 mL水活化, 将上清液过柱, 弃去滤液, 依次用6 mL水、6 mL甲醇、3 mL 0.1%甲醇氨溶液淋洗, 最后用6 mL 2%甲醇氨洗脱, 洗脱液用氮气吹近干后, 用10%甲醇水溶液定容至1.0 mL, 漩涡混合1 min, 用于LC-MS/MS测定。
称取与试样基质相匹配的阴性样品5.0 g, 加入标准系列溶液1.0 mL, 与试样同时进行提取和净化。
2 结果与讨论2.1 提取条件的选择由于部分目标药物在动物组织中以葡糖醛酸苷结合态存在, 如莱克多巴胺[12,13], 因此, 我们将试样置于乙酸-乙酸钠缓冲液中加入β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶酶解过夜。β-受体激动剂呈弱碱性, 文献报道强酸型蛋白沉淀剂如高氯酸等对其提取效果较好, 另一方面, 乙酸-乙酸钠缓冲液为弱酸性, 对目标化合物也有一定的提取作用, 此外, 加入适量的
表1 -受体激动剂的质谱采集参数
Table 1 Mass parameters for β-agonists analysis
注: *标记的离子用作定量分析
有机溶剂可能会改善提取效率。基于以上考虑, 我们比较了三种提取液: 乙酸-乙酸钠缓冲液酶解后直接超声提取、酶解后加入50%甲醇超声提取以及酶解后加入高氯酸(pH 1.0)超声提取。三种处理条件进行比较, 结果表明高氯酸提取时的回收率为48%~102%, 其中异丙喘宁和非诺特罗均低于55%。样品经酶解超声后直接过柱测定样品的回收率则为59~105%, 异丙喘宁和非诺特罗的提取效率与前者相比有明显改善; 酶解后加入50%甲醇提取的效果与直接提取相似。所以, 本实验采用酶解后直接超声提取的方法, 简化了操作步骤, 节省了试验时间。
2.2 富集净化条件的优化根据β-受体激动剂的结构特点, 本实验采用混合型强阳离子交换小柱对提取液中的目标化合物进行富集净化。采用标准加入法考察了洗脱液中氨水的浓度: 分别配制不同浓度的甲醇氨水溶液(0.02%、0.05%、0.10%、0.20%、0.5%、1.0%、2.0%和5.0%), 依次取6 mL洗脱已上样的MCX柱, 结果表明甲醇氨中氨水的浓度为0.10%时没有目标化合物流出, 浓度为2.0%时所有待测物均被洗脱下来, 因此将前者确定为林洗液, 后者为洗脱液。
此外, 我们比较了两种不同型号的强阳离子交换小柱MCX柱和PCX柱的富集净化效果。样品经酶解后, 冷冻离心合并上清液分别过MCX(6cc, 150 mg)和PCX(6cc, 200 mg)小柱, 淋洗后用6 mL 2%甲醇氨洗脱, 氮气吹干, 定容上机分析, 其结果表明两柱效果相当。本文选取了MCX固相萃取柱。
2.3 定容试剂的选择样品测定时, 定容液中甲醇的比例会直接影响到目标化合物的色谱峰形及灵敏度, 本实验分别用0%、10%、20%、30%、40%和50%的甲醇水配制10 μg/L的标准溶液进行分析, 其谱图结果显示定容液为10%甲醇水时峰形及响应值最好, 超过10%时异丙喘宁、沙丁胺醇和特布他林的峰明显的前伸和展宽, 且出现了与溶剂共流出现象。所以样品定容液中甲醇的比例不能高于10%, 否则会造成待测组分的色谱峰展宽, 降低灵敏度。
2.4 线性范围、回收率、精密度及检出限配制待测物浓度为0.5、1、2.5、5、10、25、100 μg/L的混合标准系列, 称取5.00 g试样, 并加入上述溶液, 按1.3进行前处理后上机分析。以目标组分的峰面积Y对相应的质量浓度X (μg/L)绘制标准曲线, 回归分析其相关系数均大于0.99, 表明8种目标化合物在上述浓度范围内时具有较好的线性关系。各药物
图1 加标猪肝样品色谱图
Fig. 1 LC-MS/MS chromatograms of a spiked liver sample
的方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别以最低加标浓度试样中被分析物质的定性离子信噪比为3和10时计算所得。当取样量为5 g时, 克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布它林、莱克多巴胺在动物组织中的定量限为0.10 µg/kg, 非诺特罗、福莫特罗、异丙喘宁的定量限为0.20 µg/kg。图1给出了加标浓度为0.20 µg/kg时猪肝样品的LC-MS/MS谱图。8种目标药物的回收率和相对标准偏差(RSD)见表2。三个加标水平下, 猪肉、猪肝和猪肾中8种β-受体激动剂类药物的平均回收率为75.6%~118.7%, 相对标准偏差为4.7~22.5%, 满足国际上动物性食品中兽药残留检测的要求。
表2 猪肉、猪肝和猪肾中8种目标化合物的加标回收率和相对标准偏差
Table 3 The mean recoveries and the relative standard deviation of 8 target drugs in pork, liver and kidney samples
3 结 论本研究采用MCX固相萃取柱浓缩净化, 超高压液相色谱-质谱/质谱(UPLC-MS/MS)法同时检测猪肉食品中8种β-受体激动剂, 方法回收率和精密度符合残留检测要求。该方法简便快速、灵敏度高、重现性好, 对猪肉制品的监管和保障食品安全具有重要意义。
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【篇2】猪肉瘦肉精的检测
既快速又精确
目前检测瘦肉精的方法有以下几种，胶体金快检卡是最快速简单的一种方法，适用于多种流通领域和各种实验室
一般企业会采用自己检测与外部有资质的机构测试相结合，因为样品数量巨大，如果均外部测试一是费用非常高，二是送样、检测、获得结果的周期长，效率低，无法满足实际应用的需求，所以自检也是顺应企业高效节约的宗旨的，对自己用检测出值得怀疑的样本再送检测机构检测。
一."瘦肉精"快速检测新方法初获成功盐酸克伦特罗（俗称瘦肉精），是一种饲料添加剂，能改进脂肪性动物肉和脂肪的比例，加速动物生长，但是它能够长期残留在动物体内，一般的烹饪加热不能将其消除。人们一旦食用了含有瘦肉精残留的动物性食品，便会对人们的健康造成严重危害。目前已有的快速检测方法（试剂条等），均不能定量，而定量的检测手段，大都依赖于酶联免疫（ELLSA）和高效液相色谱（HPLC）等技术，这些方法有些步骤繁琐，非常耗时，有些则需要昂贵的仪器和熟练的操作人员，并且都不能实时地监视动态反应过程等。
研制的 HPSPR－6000 表面等离子共振生物分析仪用于盐酸克伦特罗快速检测，有效地克服了现有方法的缺点，其优点有：（ 1）盐酸克伦特罗的最低检出限约为1.0ppb，接近和达到了高效液相色谱和酶联免疫等现行的方法的检出限（0.05～1.0ppb）；
（ 2）每个样品检测时间为 10min，与目前常规方法最低需要 2～3h 相比，检测时间缩短 10 倍以上；
（ 3）样品前处理简单、免标记；
（ 4）能够实时监控相互作用分子的结合、解离等动力学信息。二．快检卡：猪肉方面，目前使用胶体金试纸，只需要取一些猪肉样品，放在离心管中，在水浴中煮10分钟，将煮出的汁液加同样体积的配套缓冲液，混匀，用于检测即可，几个ppb（μg/Kg，ng/g）的瘦肉精就能被测出。北京华安麦科生物技术有限公司自主研发生产的瘦肉精类快检卡可的检出限可达到1ppb，全程只需十几分钟。
盐酸克伦特罗(瘦肉精)快速检测试剂盒采用间接竞争酶联免疫吸附法，在微孔条上预包被克仑特罗的单抗，克仑特罗的标准品（或样本中的残留物克仑特罗胺药物）与酶标记克仑特罗抗原竞争结合包被的莱克多巴胺抗体，酶标记物放大信号后，加入底物显色，终止液终止反应，酶标仪450 nm测定其吸光值。样本的吸光值与其所含残留物克仑特罗药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应克仑特罗药物的含量。
盐酸克伦特罗(瘦肉精)快速检测卡是一种检测盐酸克伦特罗（俗称：瘦肉精）的快速筛选方法，适用于猪肉肝脏、肺脏、肾脏、瘦肉样品的检测。
样本渗出液的检出限为1ng/ml。
“瘦肉精”快速检测卡应用了竞争抑制免疫层析的原理，样本中的“瘦肉精”在流动的过程中与胶体金（或胶体硒）标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上“瘦肉精”－蛋白偶联物的结合。如果样本渗出液中“瘦肉精”含量大于1ng/ml，检测线不显颜色，结果为阳性。反之，检测线显红色，结果为阴性。
【篇3】猪肉瘦肉精的检测
如何鉴别“瘦肉精”猪肉
无
【期刊名称】《广东农村实用技术》
【年(卷),期】2009(000)004
【摘要】食用含有严重瘦肉精的食品影响人体的健康安全，我国明确规定不得在猪的养殖过程中使用“瘦肉精”。
【总页数】1页(P.53-53)
【关键词】“瘦肉精”猪肉;鉴别;健康安全;养殖过程
【作者】无
【作者单位】不详
【正文语种】英文
【中图分类】S943
【相关文献】
1.“瘦肉精”猪肉的危害、鉴别及提高猪瘦肉率的正确措施 [J], 钱志锋
2.如何鉴别“瘦肉精”猪肉？ [J],
3.瘦肉精喂出肌肉发达"健美猪"——央视调查发现双汇使用"瘦肉精"猪肉 [J], 李逵
4.“精”激起万家惊——谈谈“瘦肉精”的危害及其鉴别 [J], 隽富
5.怎样鉴别含"瘦肉精"猪肉 [J], 黄子祥
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