徐 斌，安路明，孟新涛,2，张 婷,
（1.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆乌鲁木齐 830091；
2.新疆主要农副产品精深加工工程技术研究中心，新疆乌鲁木齐 830091；
3.新疆农产品加工与保鲜重点实验室，新疆乌鲁木齐 830091）
腐胺（Put）、亚精胺（Spd））和精胺（Spm）是植物中最常见和研究最多的多胺（PAs）。研究表明，PAs通过提高提高RNA酶、蛋白酶和抗氧化物酶的活性，减少活性氧的产生，保持膜的稳定性，从而提高植物对逆境的抵抗能力，已在黄瓜、西红柿、西葫芦、蓝莓等果蔬上得到证实。团队前期的研究也证实，甜瓜采后冷害发生与果皮中内源Put、Spd和Spm的含量相关，且连续2年开展了不同类型外源PAs诱导低温条件下黄皮甜瓜采后抗冷性试验，研究并步确定了施用外源2.0 mmol/L Put处理处理效果较好，然而其发生机制还尚不明确，仍需要进一步探讨研究。为此，本研究中熟品种‘新密3号’黄皮甜瓜（果皮亮黄色或黄色，发生冷害时症状较明显）为试材，研究了5±0.5℃低温诱导条件下2.0 mmol/L外源Put处理对其果实冷害和活性氧代谢的影响，解析低温条件下外源Put诱导黄皮甜瓜抗冷性的机理，以期为黄皮甜瓜采后冷害定向调控提供新思路和理论依据。
1.1 材料与仪器
黄皮甜瓜 以‘新密3号’黄皮甜瓜为供试材料，于2021年7月21日采自新疆石河子地区124团，八成熟采收，可溶性固形物含量为12%～14%，单果重2.5～3.5 kg，采后12 h内运回新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所；
腐胺（Put） 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；
蛋氨酸（MET）、氮蓝四唑（NBT） 纯度99%，上海艺恩化学技术有限公司；
丙酮、四氯化钛、乙二胺四乙酸二钠、愈创木酚、浓硫酸、邻苯二酚、对氨基苯磺酸、亚油酸钠、-萘芬、硫代巴比妥酸、三氯乙酸 国产优级纯，上海国药集团；
浓氨水、过氧化氢、盐酸羟胺 国产分析纯，天津市福晨化学试剂厂。
-80 ℃超低温冰箱 青岛海尔股份有限公司；
Centrifge 5810R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；
M20通用研磨机 德国IKA公司；
DK-8D电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；
DELA30分析天平 江苏海门士其林贝仪器公司；
UV-2600紫外分光光度计 日本岛津有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 试验设置与处理 运回的甜瓜置于8±0.5 ℃冷库中预冷24 h，然后挑选大小规格较为一致，无任何机械损伤和病虫侵害的甜瓜果实，随机分为2组：第一组使用2.0 mmol/L的外源Put（含2 g/L吐温20）进行整果浸泡处理，时间为10 min，以蒸馏水处理作为对照，每组60个果实，待果实表面自然风干后置于5±0.5 ℃条件下贮藏，环境相对湿度75%～80%，库房内间隔10 d使用二氧化氯消毒。贮藏期间，每隔7 d取一次样，每次取3个果实，用于统计果实冷害指数，另取果皮组织，-80 ℃液氮冻样，用于测定抗氧化酶活性及活性氧代谢等相关指标。以上各组处理均设置3个重复。
1.2.2 测定指标与方法
1.2.2.1 冷害指数测定 哈密瓜果实采后冷害症状主要表现为果皮出现褐色凹陷斑点，果肉呈水渍状，评定标准参照张婷的方法：冷害程度分为5级：0级，无冷害发生；
1级-冷害发生面积≤10%；
2级-11%≤冷害发生面积≤20%；
3级-21%≤冷害发生面积≤40%；
4级-冷害发生面积≥40%。
冷害指数按以下公式计算：
在制作教学课件过程中，应避免页面中文字过多，教师要发挥创意思维，运用各种形状、点、线、面等修饰内容，让教学内容简捷易懂，以最优美的方式呈现。教学内容的布局没有固定的模式，但也有一些常用的布局方式，如图4所示，竖向、横向、错位、阶梯等列表排列方式，教师还可以创作出更好看的排列方式。
1.2.2.2 酶液提取 随机称取2.0 g甜瓜果皮样品，加入 6.0 mL 0.5 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8，含0.2 mol/L EDTA和5% PVP）。充分浸提30 min，在离心机4 ℃ 12000 r/min下离心20 min，吸取上清液存于 4 ℃冰箱中，待 SOD、CAT、POD和 APX酶活性测定。
1.2.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 参照张婷的方法稍作改进。取0.1 mL粗酶液，加入3.0 ml 50 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8，内含0.13 mol/L甲硫氨酸，0.75 mmol/L氮蓝四唑（NBT），0.2 mmol/L EDTA及0.02 mmol/L核黄素），把反应液置于4000 Lx下照光20 min后，测定560 nm波长下的吸光值。以每分钟样品抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位（U），重复测量三次，结果用U·gFW表示。
1.2.2.4 过氧化氢酶（CAT）活性测定 参照代慧等的方法略作修改。向10 mL试管中加入1.9 mL磷酸缓冲液（0.5 mol/L，pH7.0）和0.1 mL之前制备的粗酶液，最后吸取1 mL的0.2% HO溶液加入试管中，启动反应。同时以蒸馏水作为空白参比，在240 nm波长下测定吸光值。每隔15 s测量一次，记录2 min内的结果，以每克甜瓜样品每分钟变化240 nm吸光值0.01为一个酶活力单位（U），重复3次，结果用U·gFW表示。
1.2.2.5 过氧化物酶（POD）活性测定 参照李顺等的方法略作有修改。取100 μL酶液，加入2.7 mL磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH7.0），加入 0.1 mL 1% 愈创木酚溶液，再加入2% HO溶液0.1 mL，混匀后启动反应，在470 nm波长下测定吸光值的变化。以OD值每分钟变化值0.01为一个酶活力单位（U），重复3次，结果用U·gFW表示。。
1.2.2.6 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参照郭欣等的方法，稍作修改。APX活性测定的反应体系包括0.1 mL 酶液，1.7 mL50 mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.0），0.1 mL 0.5 mmol/L抗坏血酸和0.1 mL 0.2 mmol/L HO充分混合，反应15 min，在290 nm波长下测定吸光值的变化。以OD每分钟变化0.01为一个酶活力单位（U），重复3次，结果用U·gFW表示。
1.2.2.7 脂氧合酶（LOX）活性测定 脂氧合酶（LOX）活性测定参照刘发强等的方法略作修改，称取甜瓜果皮冻样2 g，将10 mL预冷的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）与0.15 g的PVP混合均匀，12000 r/min，4 ℃离心处理 20 min，采集上清液检测LOX活性。采用3 mL反应体系，其中亚油酸钠母液 25 μL，50 mmol·L磷酸缓冲液 2775 μL（pH7.0），粗酶液 200 μL。在室温（25 ℃）下反应，于 234 nm处测定吸光值。加酶液15 s后开始计时，记录2 min内的OD值变化，酶活性以U·gFW表示，重复3次。
1.2.2.8 丙二醛（MDA）含量测定 参照Zheng等的方法并略作修改。随机称取3.0 g果皮组织冻样，加 7.0 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8，内含0.2 mmol/LEDTA），在 4 ℃、13000 r/min下离心20 min。取2 mL上清液加入3.0 mL 0.5%硫代巴比妥酸（溶于5%三氯乙酸），置于100 ℃沸水中反应30 min后快速冷却，10000 r/min下离心15 min测定上清液在450 nm、532 nm和600 nm下的吸光值，MDA含量根据以下公式计算：MDA含量（nmol·gFW）=[6.452×（A-A）-0.559×A]×Vt/（Vs×m），Vt、Vs分别为浸提液的总体积和反应混合液中所含浸提液的体积，m为样品质量，结果以nmol·gFW表示，每个处理3个重复。
1.2.2.9 超氧阴离子自由基（O·）生成速率测定 超氧阴离子自由基（O·）生成速率的测定参照乔沛等的方法稍作修改。称取1.0 g果皮组织冻样，加入6 mL 提取缓冲液，于4 ℃、12000 r/min 下离心20 min，收集上清液进行测定。取1 mL上清液，加入1 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）和0.1 mL 的10 mmol/L盐酸羟胺溶液，摇匀后于25 ℃反应1 h。取出反应后溶液，充分混匀。依次加入17 mmol/L对氨基苯磺酸溶液1 mL及7 mmol/L-萘胺溶液1 mL，混匀后于室温保温20 min进行显色反应。测定530 nm波长下的吸光值，根据标准曲线计算O·的物质的量。以每克甜瓜样品每分钟产生的超氧阴离子的物质的量作为超氧阴离子的产生速率，结果以nmol/（min·g）表示。
1.2.2.10 过氧化氢（HO）含量测定 过氧化氢（HO）含量测定参照陈晨等的方法并略作修改。随机称取4.0 g果皮组织冻样，加入5.0 mL预冷的丙酮，于4 ℃下10 000 r/min离心20 min。收集上清液即为样品提取液。吸取1.0 mL样品上清液，加入0.1 mL四氯化钛-盐酸溶液、0.2 mL浓氨水，混合液于12000 r/min、4 ℃下离心15 min。将离心后的上清液倒掉，用丙酮反复洗涤2～3次，直到去除色素（洗涤完之后倒掉）。再向洗涤后的沉淀物中加入5 mL 2 mol/L硫酸，完全溶解后进行比色测定。于波长412 nm处比色测定溶液的吸光值，以浓度范围从10～100 μmol/L 的 HO建立校正曲线。结果以μmol·g·FW 表示，每组 3 个重复。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2019进行数据统计，Sigma Plot 14.0作图，SPSS 20.0软件进行差异显著性分析。
2.1 外源Put处理对黄皮甜瓜贮藏期冷害指数的影响
由图1可以看出，对照组‘新密3号’果实在贮藏14 d后开始出现轻微的冷害症状，贮藏21 d后冷害指数出现较大幅度升高；
贮藏21 d外源Put处理的‘新密3号’果实出现果皮褐变等冷害症状，外源Put处理果实冷害出现时间比对照推迟了7 d。随着贮藏时间延长，两组果实冷害症状逐渐加重，冷害指数上升。贮藏35 d后，两组果实冷害症状进一步加剧，但Put处理组始终比对照组的冷害程度轻。整个贮藏期内，外源Put处理的果实冷害指数显著低于对照组（＜0.05）。可见，2.0 mmol/L外源Put处理可以延缓‘新密3号’黄皮甜瓜果实冷害的发生，同时减轻其冷害症状。
图1 外源Put处理对黄皮甜瓜冷害指数的影响Fig.1 Effect of exogenous Put treatments on chilling injury index of yellow melon fruits
2.2 外源Put处理对黄皮甜瓜贮藏期果皮SOD活性的影响
SOD是活性氧代谢的关键酶之一，可有效清除机体损伤产生的有害自由基，减少机体受损。黄皮甜瓜SOD活性变化如图2所示，对照组甜瓜SOD活性呈先上升再下降的变化趋势，而Put处理组SOD活性出现了波动，分别在第14 d和第35 d时出现了峰值，这与冷害指数出现快速升高的时间基本一致。在贮藏前期（0～14 d），SOD活性不断上升，这表明低温胁迫下甜瓜自身会产生调节代谢保护性反应以减少冷害的发生。贮藏第7 d与贮藏0 d比较，对照组增加了48.71%，Put处理更能激发甜瓜SOD的活性，是对照组的 2.62倍。贮藏后期（35～49 d），两组SOD活性不断降低，期间黄皮甜瓜果实冷害症状加重，冷害指数出现大幅升高，SOD酶清除冷害发生过程中产生的自由基消耗量持续增加，导致其活性逐渐降低，至贮藏第49 d时，2.0 mmol/L Put处理组黄皮甜瓜果皮SOD活性为对照组的2.13倍。可以看出，2.0 mmol/L Put处理组的SOD活性显著高于对照组（＜0.05），表明外源Put处理组果皮组织内清除自由基能力优于对照组。
图2 外源Put处理对黄皮甜瓜SOD活性的影响Fig.2 Effect of exogenous Put treatments on SOD activity of yellow melon fruits
2.3 外源Put处理对黄皮甜瓜贮藏期果皮CAT活性的影响
CAT是植物细胞内重要的活性氧清除酶，能够分解植物体内的HO，以减少HO的积累对果实组织造成氧化损伤。由图3可知，黄皮甜瓜在贮藏过程中，随贮藏时间的延长，两个处理组果皮中CAT活性均呈先上升后下降的趋势，贮藏21 d时达到最大值，其中2.0 mmol/L Put处理的黄皮甜瓜果皮CAT活性约为对照组的2.3倍，此时正值冷害症状急剧出现时间，整个贮藏期内，Put处理组黄皮甜瓜果皮的CAT活性显著高于对照组（＜0.05）。可见，2.0 mmol/L Put处理可促进黄皮甜瓜低温贮藏期间果皮CAT活性的升高，这种效果在冷害加剧出现时尤为明显。
图3 外源Put处理对黄皮甜瓜CAT活性的影响Fig.3 Effect of exogenous Put treatments on CAT activity of yellow melon fruits
2.4 外源Put处理对黄皮甜瓜贮藏期果皮POD活性的影响
POD广泛存在于植物中，在果实体内主要参与活性氧的清除过程，与机体逐渐衰老或者环境胁迫作用密切相关。如图4所示，随贮藏时间延长，两个处理组黄皮甜瓜果皮中POD活性呈先上升后逐渐降低的趋势，均在贮藏第21 d达到峰值，这与CAT变化趋势一致。贮藏第21 d时，2.0 mmol/L Put处理组的POD活性最高，是对照组黄皮甜瓜果皮POD活性的1.6倍。贮藏28 d之后，对照组POD活性出现了小幅升高的现象，这可能与低温胁迫下激发机体的防御反应有关。贮藏42 d时，Put组黄皮甜瓜果皮的POD活性是对照组的4.57倍，且整个贮藏期内，Put处理组POD活性始终高于对照组，由此表明，Put处理可显著增强低温贮藏期间黄皮甜瓜果皮POD 的活性（＜0.05）。
图4 外源Put处理对黄皮甜瓜POD活性的影响Fig.4 Effect of exogenous Put treatments on POD activity of yellow melon fruits
2.5 外源Put处理对黄皮甜瓜贮藏期果皮APX活性的影响
果蔬发生冷害后，会引起氧化胁迫，造成活性氧自由基大量积累，抗坏血酸过氧化物酶（APX）作为植物抗氧化防御系统的成员之一，在防御活性氧自由基破坏作用方面扮演着重要角色。如图5所示，贮藏期间，黄皮甜瓜果皮的APX活性随贮藏时间的延长呈先升高后降低的变化趋势，这与CAT、POD活性的变化趋势相似。APX活性在0～21 d时间内逐渐上升，贮藏7 d时，两组处理APX活性较低，其值基本维持在10 U·gFW左右，之后随着冷害的出现，APX活性快速升高，贮藏21 d，两组处理的APX活性均达到峰值，分别为39.14和33.65 U·gFW，这可能是果实对冷害产生的应激反应，通过自身提高APX酶活性来抵御冷害的发生，Put处理因减轻冷害使其维持较高的水平。贮藏28～49 d，两个处理组黄皮甜瓜果皮组织中的APX酶活性随着冷害的加重呈逐渐下降的趋势，其原因可能是冷害的发生导致组织内活性氧自由基的大量出现，APX酶需要发挥防御作用，其活性随之逐渐下降。贮藏49 d，2.0 mmol/L Put处理组的黄皮甜瓜果皮APX活性是对照组的4倍，表明2.0 mmol/L Put处理能够显著提高低温贮藏期间黄皮甜瓜果皮APX活性（＜0.05），从而相对提高果实的抗冷能力。
图5 外源Put处理对黄皮甜瓜APX活性的影响Fig.5 Effect of exogenous Put treatments on APX activity of yellow melon fruits
2.6 外源Put处理对黄皮甜瓜贮藏期果皮LOX活性的影响
LOX是催化膜脂上的不饱和脂肪酸发生过氧化作用的酶，低温可诱导果蔬LOX活性的上升。如图6所示，贮藏期内，两个处理组黄皮甜瓜果皮的LOX活性随贮藏时间延长呈逐渐上升的变化趋势，这种上升趋势在贮藏14 d后尤其明显，这与冷害出现时间一致。贮藏前期，对照组果皮的LOX活性出现快速上升，Put处理组果皮的LOX活性上升缓慢。贮藏第21 d，对照组LOX活性较0 d时上升了4.18倍，Put处理组LOX活性较采收0 d上升了3.04倍，比对照组降低了27.3%。至贮藏结束时，对照组LOX活性是Put处理组的1.58倍。贮藏7、21、42和49 d时，2.0 mmol/L Put处理组的LOX活性显著低于对照组（＜0.05），但其它贮藏时间，两者间差异不显著（＞0.05）。由此表明，Put处理可在一定程度上抑制黄皮甜瓜低温贮藏期间果皮LOX的活性。
图6 外源Put处理对黄皮甜瓜LOX活性的影响Fig.6 Effect of exogenous Put treatments on LOX activity of yellow melon fruits
2.7 外源Put处理对黄皮甜瓜贮藏期果皮MDA含量的影响
丙二醛（MDA）是膜脂过氧化作用的产物，其含量变化表征细胞膜受伤害的程度，可作为评价果蔬细胞膜完整性与冷害程度的指标。如图7所示，黄皮甜瓜在低温贮藏期间，两组果皮MDA含量随着贮藏时间的延长总体呈现上升趋势，这与LOX变化趋势一致，说明果实在受到低温胁迫时，脂质自由基进一步诱发膜脂过氧化，进而促使MDA的积累。贮藏第21 d时，2.0 mmol/L Put处理组MDA含量显著低于对照组（＜0.05），是对照组的0.56倍；
至贮藏结束时，Put处理组MDA含量比对照组低24.5%。在整个贮藏期内，Put处理组的MDA含量始终低于对照组。由此表明，Put处理能够抑制丙二醛含量的积累，减缓果皮组织膜脂过氧化程度，从而减轻其冷害损伤。
图7 外源Put处理对黄皮甜瓜MDA含量的影响Fig.7 Effect of exogenous Put treatment on MDA content of yellow melon fruit
2.8 外源Put处理对黄皮甜瓜贮藏期果皮O2·-生成速率的影响
超氧阴离子自由基（O·）是活性氧代谢的主要产物，O·产生速率可以作为衡量果蔬冷害发生程度的重要指标。如图8所示，在贮藏期内，Put处理组和对照组的超氧阴离子自由基生成速率变化一致，总体呈上升趋势，对照组O·生成速率始终高于Put处理组。在贮藏前期（0～14 d），Put处理组 O·的生产成速率和对照组差异不显著（＞0.05），但Put处理组的超氧阴离子自由基生成速率低于对照组。在贮藏第42 d时，两组的O·生成速率均达到最大值，分别较0 d增加了2.90和7.78倍，对照组的O·生成速率显著高于Put处理组（＜0.05），是 Put处理组的 2.3 倍。贮藏前期（0～35 d），两个处理组 O·生成速率均处于较低水平，贮藏后期（35～49 d），两个处理组O·生成速率均处于较高水平，这可能与SOD活性的变化有关。由此可见，Put处理可抑制超氧阴离子自由基的产生，维持细胞膜的稳定性，从而降低活性氧对细胞膜脂质过氧化损害的程度。
图8 外源Put处理对黄皮甜瓜O2·-生成速率的影响Fig.8 Effect of exogenous Put treatments on O2·-generating rate of yellow melon fruits
2.9 外源Put处理对黄皮甜瓜贮藏期果皮H2O2含量变化的影响
果实细胞内自由基的产生和清除在正常情况下处于动态平衡状态，体内维持稳定的活性氧水平。但当处于冷胁迫条件下，这种平衡被破坏，导致活性氧大量积累。HO是植物体内主要的自由基，其含量变化在一定程度上可以反映自由基产生情况。如图9 所示，贮藏前期（0～14 d），两组果皮中 HO含量均呈较低水平，Put处理组HO含量相较于初始值呈下降的变化，贮藏14 d后，两组果皮中HO含量均出现升高，这与冷害指数的变化一致。贮藏第14 d，Put处理组的HO含量比对照组低20.3%。贮藏第35 d时，Put处理组HO含量较0 d增加了1.57%，而对照组HO含量增加了53.14%，是Put处理组的1.51倍。贮藏期内，对照组HO含量始终高于Put处理组，由此表明，Put处理能够抑制黄皮甜瓜低温贮藏期间果皮中HO的积累，使HO含量保持在较低水平。
图9 外源Put处理对黄皮甜瓜H2O2含量的影响Fig.9 Effect of exogenous Put treatments on H2O2 content of yellow melon fruits
一般情况下，甜瓜受到低温胁迫时，正常生理代谢受到影响，活性氧代谢平衡遭到破坏，前人研究也证实了甜瓜果实采后冷害发生与其抗氧化系统有着密不可分的联系。本研究发现，‘新密3号’黄皮甜瓜5 ℃低温贮藏过程中，外源Put处理显著提高了其果皮组织中SOD、POD、CAT和APX等的活性，抑制了O·生成速率和HO浓度，从而提高其抵御低温的能力，这与外源Put诱导西蓝花、猕猴桃、芒果、辣椒及番茄等果蔬低温抗冷性减轻其冷害发生的研究结果较为一致。当植物发生冷害时，会产生大量自由基，造成膜脂损伤，导致膜脂氧化产物MDA的积累，且MDA含量水平与LOX活性有关。本研究表明，与对照组相比，Put处理可在一定程度上抑制黄皮甜瓜果皮组织LOX活性的增加和MDA含量的积累，表明外源Put处理可减轻膜脂氧化造成的损伤，从而减轻并延缓其果实采后冷害的发生，这与外源Put应用于桃子和秋葵等果蔬上的报道较为相似。然而，果蔬采后低温诱导中活性氧代谢调控网络十分复杂，是否与其它相关酶活性或代谢相关，仍有待于进一步探索。
可见，5±0.5 ℃低温诱导条件下，2.0 mmol/L外源Put处理可显著降低‘新密3号’黄皮甜瓜的冷害指数，提高其果皮组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性，抑制脂氧合酶（LOX）的活性，减少过氧化氢（HO）、超氧阴离子自由基（O·）和丙二醛（MDA）的积累，从而减轻‘新密3号’黄皮甜瓜果实采后冷害发生症状，使其冷害发生时间推迟7 d，该结果可为生产中黄皮甜瓜采后冷害调控提供新思路。
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