徐蕾蕊，李 丹，汪 琦，马 丹，魏咏新，魏海燕，赵晓娟，张西萌，曾 静
（中国海关科学技术研究中心，北京 100026）
诺如病毒（norovirus，NoV）为正向单链RNA病毒，分为5 个基因型（GI～GV），大多数感染人类的NoV属于GI型和GII型，引起腹泻呕吐等急性症状，严重可致死亡。NoV主要通过污染食品进行传播，食品中含有微量NoV即可引起感染。因此需要建立科学、高效的食品中NoV检测手段，控制NoV引起的疾病，保障人民健康。
数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术通过将反应体系无限稀释，可使PCR扩增的荧光信号由指数形式转换为数字信号，检测灵敏度提高到单分子水平。目前，微滴式数字PCR平台中的逆转录微滴式聚合酶链式反应（reverse transcriptase droplet digital polymerase chain reaction，RT-ddPCR）无需单独进行逆转录反应，直接定量RNA，可作为食品中NoV定量检测的有效技术手段。
食品中NoV定量需要病毒浓缩、核酸提取纯化等前处理过程，但此过程中病毒回收率未知，故RT-ddPCR定量结果不等于食品中NoV实际载量。需要建立简便操作性强的过程控制程序，指示NoV回收率，换算食品中NoV实际载量。MS2噬菌体是一种无包膜+ssRNA病毒，大小和结构与NoV比较接近，可作为过程控制模式病毒添加到食品样品中。
本研究拟以RT-ddPCR检测体系为基础，建立NoV定量检测方法，探索MS2噬菌体的过程控制程序，构建基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法。
1.1 材料、试剂与仪器
牡蛎、苹果、羽叶生菜和草莓 市购。
GI、GII型NoV、星状病毒（humanastrovirus，HastV）、甲肝病毒（hepatitis A virus，HAV）、轮状病毒（rotavirus，RV）RNA，MS2噬菌体悬液（效价7.2×10PFU/mL），本实验室保存；
GI型NoV RNA标准物质（特性值（5.4±1.2）×10拷贝/μL）和GII型NoV RNA标准物质（特性值（5.9±1.2）×10拷贝/μL），本实验室研制保存；
GII型NoV阳性粪便样品，由北京儿童医院赠送。
焦碳酸二乙酯（diethyl paracanbonate，DEPC）处理水、蛋白酶K 天根生化科技（北京）有限公司；
总RNA提取试剂Trizol、SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR system 美国英杰生命技术有限公司；
无水乙醇、异丙醇、氯仿 国药集团化学试剂北京有限公司；
QIAamp Virial RNA Mini Kit 德国QIAGEN公司；
Dynadbeads mRNA Purification Kit 美国Life Technology公司；
One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes 美国伯乐公司。
热循环仪、实时荧光PCR仪 美国应用生物系统公司；
QX-200数字PCR系统、微滴生成仪 美国伯乐公司；
微定量核酸蛋白分析仪 美国赛默飞世尔科技公司。
1.2 方法
1.2.1 引物探针设计和筛选
根据NoV基因型分型保守区域：编码RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）区域和开放阅读框2（Open Reading Frame 2，ORF2）编码主要结构蛋白VP1区域，通过NCBI在线工具进行序列分析和比对，利用Prime Express软件V4.0（ABI,Foster City,CA,USA）分别设计GI型和GII型NoV引物和探针；
对于MS2噬菌体，选取Dreier等设计的引物和探针，通过NCBI在线工具BLAST进行序列分析和比对，确定目的片段同源性。分别取实验室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌体RNA为模板，首先采用荧光PCR方法对设计的引物探针进行筛选和特异性验证，再采用RT-ddPCR体系进一步验证筛选的引物探针的特异性。反应参数：荧光PCR：50 ℃反转录15 min，95 ℃热启动2 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火延伸1 min、40 个循环；
RT-ddPCR：参照One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes试剂盒说明书配制反应体系，60 ℃反转录60 min，95 ℃热启动10 min，95 ℃变性30 s、60 ℃退火延伸1 min、40 个循环，98 ℃酶失活10 min，4 ℃保持，升降温速率2～3 ℃/s。
1.2.2 RT-ddPCR体系扩增温度优化
分别以实验室保存的GI、GII型NoV RNA和提取的MS2噬菌体RNA为模板，按One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes试剂盒说明书，分别在不同退火温度下进行扩增反应，以阳性微滴扩增强度为标准，对筛选出的引物探针退火温度进行优化。
1.2.3 GI、GII型NoV和MS2噬菌体RT-ddPCR定量检测方法学评估
1.2.3.1 3 个RT-ddPCR定量检测方法的定量限和准确性分析
MS2噬菌体核酸拷贝浓度测定：取MS2噬菌体悬液100 μL，提取RNA后溶于100 μL DEPC水，应用微定量核酸蛋白分析仪测定其OD、OD/OD及核酸质量浓度值，重复测定5 次，取平均值作为提取的RNA核酸质量浓度值。计算提取的MS2噬菌体核酸拷贝浓度，公式如下：
将保存的GI、GII型NoV RNA标准物质和提取的MS2噬菌体RNA分别按多倍梯度稀释，每个梯度各取2 μL，分别进行RT-ddPCR检测，每个梯度重复检测4 次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），分别确定3 个RT-ddPCR定量检测方法的定量限，分析检测值与理论值之间的关系，确定检测体系的准确性。
1.2.3.2 3 个RT-ddPCR定量检测方法的重复性分析
分别取GI、GII型NoV RNA标准物质和提取的MS2噬菌体RNA为模板，按10 倍梯度稀释，各取高、低两个梯度进行相应的RT-ddPCR检测，每个梯度各取2 μL。每种模板分别各取3 个平行进行稀释，每个平行每个梯度重复检测6 次，同时设置1 个空白对照（DEPC水）。计算各样品各梯度的检测值与其理论值的偏差，分析检测方法的重复性。
1.2.4 实际样品中添加MS2噬菌体对NoV定量检测结果的影响分析
由于CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基质的前处理方法不同，选择贝类（牡蛎）、硬质表面食品（苹果）、生食蔬菜（羽叶生菜）以及软质水果（草莓）4 种食品基质用于制备阳性样品。根据CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同食品基质的检测用量，分别向牡蛎消化腺2 g、苹果（带皮）表面100 cm、羽叶生菜25 g和草莓25 g样品中添加100 μL实验室保存的NoV阳性粪便样品（GII型NoV），静置30 min，每种基质制备两份平行阳性样品。制备的阳性样品（包括牡蛎消化腺2 g、苹果（带皮）表面100 cm、羽叶生菜25 g和草莓25 g）全部用于RT-ddPCR定量检测。各阳性样品参照CEN ISO/TS 15216-2:2019中不同不同食品基质的前处理方法进行病毒洗脱和浓缩，其中一份阳性样品在前处理过程中添加100 μL MS2噬菌体悬液，另一份平行的阳性样品不添加MS2噬菌体悬液。病毒洗脱和浓缩后，提取RNA溶于100 μL DEPC处理水中。将提取的阳性样本RNA分别进行GII型NoV和MS2噬菌体RT-ddPCR定量检测，每份样品重复检测6 次，分析添加MS2噬菌体对阳性样品中NoV定量检测结果的影响。
1.2.5 基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法的实际应用
从超市或市场购入贝类样品23 份、硬表面食品8 份、生食蔬菜9 份、软质水果15 份，共计55 份样品。硬表面食品和生食蔬菜购入后立即进行检测或保存于4 ℃，贝类和软质水果可立即进行检测，或者保存于-80 ℃。参考CEN ISO/TS 15216-2:2019中对不同食品基质的检测用量的规定，分别取贝类消化腺2 g、硬表面食品表面积100 cm、生食蔬菜25 g、软质水果25 g，采用基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法进行NoV筛查和定量检测，且每份实际样品在检测前，均添加100 μL实验室保存的MS2噬菌体悬液作为过程质控，分析不同食品基质中MS2噬菌体的回收率，并计算阳性样品中NoV实际载量。
1.3 统计分析
采用SPSS 17.0统计软件分析各组之间的差别，统计方法采用检验和单因素方差分析，检验水平=0.05。
2.1 引物探针筛选结果
根据NoV基因型分型保守区域分别设计出3 组GI型NoV引物、探针和4 组GII型NoV引物、探针，引物探针序列未给出。荧光PCR筛选结果表明，针对GI型和GII型NoV的各组引物探针均能有效扩增出靶基因，其中来源于GB 4789.42—2016《食品微生物学检验 诺如病毒检验》的引物探针COG1-F/R/RING1-P和COG2-F/R/RING2-P具有较高的扩增效率，可筛选分别用于构建GI、GII型NoV RT-ddPCR体系。对其特异性进行验证（图1）。荧光PCR特异性验证结果表明，筛选的GI型NoV特异性COG1-F/COG1-R/RING1-P、GII型NoV引物探针COG2-F/COG2-R/RING2-P和MS2噬菌体引物探针MS2-TM3-F/R/P特异性良好（图2），各筛选的引物探针序列见表1。
图1 荧光PCR筛选引物探针Fig.1 Screening of primers and probes by fluorescence PCR assay
图2 荧光PCR验证引物探针特异性Fig.2 Specificity of selected primers and probes verified by fluorescence PCR assay
表1 筛选的RT-ddPCR引物探针序列Table 1 Sequences of selected primers and probes for RT-ddPCR assay
RT-ddPCR特异性验证结果表明，3 个RT-ddPCR体系只有各自对应目的片段特异性扩增，其余病毒经检测均呈阴性，证明筛选的3 组引物探针在RT-ddPCR体系中特异性良好（图3）。
图3 RT-ddPCR检测方法特异性实验结果Fig.3 Specificity of RT-ddPCR assay
2.2 RT-ddPCR检测体系优化结果
由图4A、B可见，50 ℃条件下GI、GII型NoV目的基因片段的扩增效率均偏低，阳性微滴和阴性微滴分界不明显；
55 ℃和60 ℃条件下目的基因片段扩增效率较高，可出现比较明显的阳性微滴簇，且55 ℃条件下扩增的荧光信号略高于60 ℃，因此，将55 ℃作为GI和GII型NoV RT-ddPCR检测体系的最佳最火温度；
由图4C可见，55 ℃条件下MS2噬菌体目的片段的扩增效率偏低，阳性微滴和阴性微滴分界不明显；
57.5、60 ℃和62.5 ℃条件下目的基因片段扩增效率较高，阳性微滴和阴性微滴可明显分解，且62.5 ℃条件下扩增的荧光信号略高于57.5 ℃和60 ℃，因此，将62.5 ℃作为最佳退火温度。
图4 RT-ddPCR检测体系在不同退火温度下扩增结果Fig.4 Amplification efficiencies of RT-ddPCR assay at different annealing temperatures
2.3 RT-dd PCR检测体系的定量限和准确度
对于MS2噬菌体RNA，5 次重复测量得到的核酸浓度平均值为1.269 μg/mL（测量结果未给出）。MS2噬菌体为单链RNA病毒，基因组由3 569 个核苷酸组成，故计算得到的MS2噬菌体RNA拷贝浓度为6.29×10拷贝/μL。
将GI、GII型NoV RNA标准物质和MS2噬菌体RNA分别按多倍梯度稀释，直至稀释浓度分别为5.4、5.9 拷贝/μL和6.29 拷贝/μL，每个梯度4 个重复实验，分别进行RT-ddPCR检测。结果表明，GI和GII型NoV的RT-ddPCR检测最后两个稀释倍数的RSD均较大，但是均在25%以内，表明这两个检测体系的绝对定量检测灵敏度均可达到5 拷贝/μL；
而MS2噬菌体RT-ddPCR检测RSD为4.5%～42.0%，对单个拷贝浓度样品的4 次重复的RSD达到42%，故MS2噬菌体RT-ddPCR检测的绝对定量检测灵敏度可达到10 拷贝/μL梯度（表2）。
表2 RT-ddPCR检测体系的定量限和准确度（n＝4）Table 2 Limits of quantitation and accuracy of RT-ddPCR assays (n=4)
3 个体系所检测的浓度值与相应的理论浓度值均具有很好的线性关系，并且与理论拷贝数相符，3 个RT-ddPCR检测体系分别能够对GI、GII型NoV和MS2噬菌体进行准确定量（图5）。
图5 RT-ddPCR检测体系的线性关系Fig.5 Linear relationship of RT-ddPCR assays
2.4 RT-dd PCR检测体系的重复性
对于高浓度样品和低浓度样品，3 个RT-ddPCR检测体系的RSD 均小于25%，与理论值的偏差为0.34%～15.63%，单因素方差分析发现，各RT-ddPCR检测体系的3 个重复检测值之间无显著差异（＞0.05），可见RT-ddPCR检测体系的重复性均较好（表3）。进一步分析数据发现，高浓度样品3 个平行样品的测定RSD总体上低于低浓度样品，可见模板的浓度对RT-ddPCR检测体系的重复性影响较大，样品浓度范围在10～10数量级范围内时，RT-ddPCR检测体系能够较好地对目的模板进行定量检测。
表3 RT-ddPCR检测体系的重复性（n＝6）Table 3 Repeatability of RT-ddPCR assays (n=6)
2.5 MS2噬菌体对食品中NoV RT-ddPCR定量检测结果的影响
贝类消化腺（牡蛎消化腺）、硬表面食品（苹果）、生食蔬菜（羽叶生菜）和软质水果（草莓）4 种食品基质中，添加与未添加MS2噬菌体过程控制的平行样品，GII型NoV定量检测结果相近，检验结果值均大于0.05，差异无统计学意义（表4）。4 种食品基质过程控制回收率分别均大于1%，均符ISO/TS要求。添加了MS2噬菌体的样品可通过将GII型NoV定量检测结果除以回收率，得到NoV载量，均达到了10拷贝数量级，RSD为2.4%。
表4 不同食品基质中NoV样品定量检测结果（n＝6）Table 4 Results of quantitative detection of norovirus in different food matrixes (n=6)
2.6 食品中NoV RT-ddPCR定量检测方法的应用
实际样品检测结果表明（具体数据未给出），在23 份贝类样品中有2 份检出GII型NoV RNA，检出率为8.70%。硬表面食品、生食蔬菜和软质水果样品中均未检出食源性病毒。不同的食品基质中MS2噬菌体作为过程控制的回收率不同，贝类消化腺中的过程控制回收率在18.2%～78.6%之间，硬表面食品中的过程控制回收率在9.4%～58.2%之间，生食蔬菜中的过程控制回收率在8.5%～32.2%之间，软质水果中的过程控制回收率在1.7%～19.9%之间。
NoV是引起急性暴发非细菌性胃肠炎的首要致病原体，美国疾病控制与预防中心监测研究估计30%～50%的食物源性胃肠炎暴发与NoV有关。NoV通过污染肥料或水体进入食物链，被污染的水体中生长的滤食性贝类，可浓缩水体中的NoV，当人类生食来自被NoV污染水体中的贝类或者食用未熟透的贝类时，可感染NoV；
此外携带了NoV的食品加工者也可能将病毒颗粒转移到食品上。由此可见，被NoV污染的食物是其传播的关键，建立科学、高效的食品中NoV检测手段，对控制NoV引起的疾病，保障人民健康具有重要意义。
数字PCR技术将PCR体系分割为许多独立的反应单元，模板在独立的反应单元中进行PCR扩增，检测每个反应单元是否有荧光信号判断是否含有扩增模板，通过泊松统计学处理，不依赖标准曲线和循环阈值可直接定量核酸拷贝数。定量检测RNA时，需要将RNA反转录为cDNA。Kiselinova等在两步法反转录数字PCR对定量检测HIV RNA时，仍然需要依赖标准曲线计算RNA的拷贝浓度。RT-ddPCR可避免反转录给定量结果带来的偏倚，目前已有研究成功利用RT-ddPCR实现水体中的RV RNA直接定量检测，灵敏度与real-time PCR相当。
本研究以实验室保存的GI、GII型NoV RNA标准样品为模板，分析构建的NoV RT-ddPCR检测体系的检出限包括10～10拷贝/μL 5 个数量级。RT-ddPCR对高浓度模板样本检测能力受限，主要原因是ddPCR平台仅可生成小于20 000 个微滴，当模板浓度达到10拷贝/μL数量级，不能通过泊松分布计算模板含量。但是对于低浓度模板样本，RT-ddPCR具有较小的变异系数和更高的灵敏度，Tang Hui等结果表明，ddPCR具有更好的可重复性，对低拷贝的质粒标准品的定量检测优于实时荧光PCR。Yan Yong等发现，dd PCR能够从real-time PCR检测阴性的咽拭子标本中检测出流感病毒载量，其检测灵敏度更高。
基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法，需要构建过程控制程序，采用的模式病毒应具备以下条件：1）可建立RT-ddPCR检测体系，具有与NoV相当的准确性、灵敏度和变异性；
2）容易培养，无生物危害，能够确定效价；
3）与NoV基因有明显区别，不影响检测结果；
4）在自然状态中不出现，只能人为添加到被检测食品中。MS2噬菌体是一种无包膜+ssRNA病毒，侵染宿主为F+（雄株）大肠埃希氏菌，大小和结构与NoV比较接近，可通过计数噬菌斑确定其效价，对人体没有致病性，基因组不含NoV的靶基因序列。本研究建立了MS2噬菌体RT-ddPCR检测体系，准确性、定量限和重复性与NoV RT-ddPCR检测体系相当，且不影响食品中NoV的RT-ddPCR定量结果，因此，可作为过程控制的模式病毒被添加到食品中指示回收率，计算食品中NoV的实际载量。
采用本研究建立的基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法，对市售的食品样品进行检测，结果仅在贝类样品中检出NoV，检出率为8.7%，与Cheng等的研究中的检出率相近，而在硬表面食品、生食蔬菜和软质水果样品中均未检出NoV。出现以上结果与不同食品基质中NoV污染方式不同有关。贝类为滤食性动物，可将被NoV污染水体中的病毒颗粒富集到消化腺中。有研究表明，被NoV污染的水体中，贝类经过4～5 h的生物富集作用，每个贝类消化腺中可达到＞1 000 NoV载量，贝类消化腺中的NoV浓度可高于周围水体数十倍至数千倍，而且在净化后的贝类中也常常检出NoV。硬质表面食品、生食蔬菜和软质水果没有生物蓄积过程，即使被NoV污染，其污染水平可能远达不到贝类消化腺中的NoV浓度。
本研究建立了基于RT-ddPCR技术的食品中NoV定量检测方法，可定量检测单个拷贝数量级的NoV核酸。NoV通常富集或吸附于不同食品基质内部或者表面，需要经过病毒洗脱浓缩、核酸提取纯化等前处理，才能对食品中的NoV进行定量检测，但是前处理过程往往可导致NoV颗粒大量损失，造成RT-ddPCR定量结果与食品中NoV实际载量不匹配的现象。由此可见，后续需要针对优化NoV洗脱浓缩，改善核酸提取效率，提高NoV整体回收率等方面进一步研究，以提升RT-ddPCR检测体系对食品中NoV定量检测的准确性。
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