王 芳，李 峰
（西安国际医学中心医院 药学部，陕西 西安 710010）
自2019 年12 月份以来，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已波及210 多个国家和地区，影响70多亿人口。此病传染性强、传播速度快，属我国中医“瘟疫”“疫病”范畴，病因为感受“疫戾”之气。轻度患者会出现发热、乏力、干咳等症状，严重者出现呼吸困难、呼吸窘迫综合征或脓毒症休克等症[1]。防疫期间，国家卫生健康委员会及国家中医药管理局印发《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》从试行第三版到第八版中都将中医治疗法纳入其中[2]。已有治疗结果表明，相比于西医治疗组，中医治疗组在治疗COVID-19 上有显著疗效，尤其在普通型转重型及危重型发生率和死亡率指标的对比上优越性明显[3-4]，进而证明了中医药在防疫中发挥了重要作用。
二妙方是中国古代经典的一种中草药配方，载于元代医家朱丹溪的《丹溪心法》，并记录在《中国药典》之中，它是由黄柏和苍术组成的清热祛湿剂[5]。黄柏、苍术的配伍使用是临床上的常用药对[6]，是治疗湿热下注的基础方。黄柏味苦、性寒，寒以清热，苦以燥湿。苍术味苦、性温，燥湿健脾。中医诊断COVID-19 主要以湿毒郁肺、疫毒闭肺及湿热蕴毒为主，由此设想二妙方是否对COVID-19 有效?因此对其化学成分及作用机制展开研究。中药网络药理学为中药研究提供了新的思路，从分子水平上对药物-靶点-疾病网络进行全方位的探索和预测，从理论上解决了中药成分复杂难以切入研究的根本问题[7]。网络药理学与中医理论的整体观念、辨证论治相一致[8]。
因此，本研究采用网络药理学的方法，探索二妙方对治疗COVID-19 的潜在作用机制，为二妙方进一步临床应用于COVID-19 提供理论依据。
1.1 二妙方活性成分的筛选
本研究借助TCMSP 数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php），分别检索关键词“黄柏”“苍术”，经过设置OB ≥30%且DL ≥0.18 进行筛选[9]，得到黄柏、苍术的生物活性成分。
1.2 二妙方活性成分作用靶点的收集
通过Pubchem Cid 获得Canonical SMILES 结构，将结构化学式输入到SwissTargetPrediction 靶点预测平台（http://www.swisstargetprediction.ch/），获得每一活性成分的潜在作用靶点。
1.3 二妙方抗COVID-19 相关靶点收集
利用GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）对COVID-19 相关靶点进行收集，将收集到的疾病靶点与“1.2”项下获得的成分作用靶点取交集，最终获得二妙方抗COVID-19 的相关作用靶点。
1.4 靶点蛋白互作网络（PPI）构建
将收集到的上述各类靶点导入到STRING 数据 库（https://string-db.org/）， 物 种 选 择“Homo sapiens”，获得靶蛋白互作数据，使用Cytoscape3.2.1软件构建PPI 网络。
1.5 靶点的通路分析
为了更深入地了解上述筛选得到的靶点蛋白基因的功能及在信号通路中的作用，将筛选到的靶点导 入DAVID 数 据 库（https://david.ncifcrf.gov/），限定物种为人，将所有靶基因名称校正为其官方名称（OFFICIAL_GENE_SYMBOL），进行GO 和KEGG通路富集分析，并进行数据可视化处理。
1.6 分子对接预测
从PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载黄柏和苍术的所有化合物结构，从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载ACE2 受体和3CLpro 的三维结构。活性成分和蛋白结构通过Pymol和AutoDockTools 进行修饰[10]。结合能可用于评价化合物与目标物的结合程度。结合能小于-5 kJ/mol，表明目标物与组分具有一定的结合活性[11]。
2.1 二妙方活性成分的筛选结果
在TCMSP 数据库中检索关键词“黄柏”“苍术”分别获得140 和49 个化学成分。采用了OB ≥30%和DL ≥0.18 作为活性成分的筛选条件，结果见表1。
表1 黄柏和苍术的46 个活性成分Tab.1 46 active components of Huangbo and Cangzhu
2.2 二妙方抗COVID-19相关靶点网络的构建与分析
通过TCMSP 数据库活性成分的Pubchem Cid 查询相关的潜在靶点，共有517 个。从Genecards 数据库筛选得到259 个COVID-19 疾病靶点，与517 个成分靶点取交集，得到39 个重合靶点，即为黄柏-苍术治疗新型冠状病毒肺炎的相关靶点，主要靶点如MAPK1、MAPK3、EGFR、CXCL8、CASP3、MAPK8、JAK1、MAPK14、BCL2L1 等，见图1。
图1 二妙方治疗新型冠状病毒肺炎的靶点图Fig. 1 An interactive network of pathogenic targets of COVID-19 and putative targets of Ermiao Fang
2.3 GO 与KEGG 富集分析结果
使用DAVID 数据库对潜在靶点进行GO 分析，共富集69 个生物学过程和功能（P＜ 0.05），其中包括生物过程（BP）45 个，细胞成分（CC）8 个，分子功能（MF）16 个，根据-Log10（P）校正后进行排序，各类前10 的通路见图2。
图2 39 个潜在作用靶点的GO 功能富集分析Fig. 2 GO enrichment analysis of the 39 targets of Ermiao Fangtreating COVID-19
通过KEGG 通路分析得到98 个（P＜ 0.05）包含52 个疾病通路和46 个信号通路，其中，与肺损伤、病毒感染相关的疾病通路有10 个，包括：Non-small cell lung cancer、Small cell lung cancer、Hepatitis B、Hepatitis C、Viral carcinogenesis、Influenza A、Epstein-Barr virus infection、HTLV-I infection、Tuberculosis、Herpes simplex infection。
信 号 通 路中已报道与肺炎相关的信号通路有HIF-1 signaling pathway[12]、Toll-like receptor signaling pathway[13]、T cell receptor signaling pathway[14]、TNF signaling pathway[15]、ErbB signaling pathway[16]等。排名前20的通路见图3。其中，关键靶点富集较多的是TNF信号通路（图4A）和ErbB 信号通路（图4B）。众所周知这两条通路对炎症免疫的影响很大，提示了黄柏-苍术可能通过抗炎作用治疗COVID-19。
图3 39 个潜在作用靶点的KEGG 通路富集分析Fig. 3 KEGG enrichment analysis of the 39 targets of Ermiao Fang treating COVID-19
图4 TNF 信号通路和ErbB 信号通路Fig. 4 TNF and ErbB pathway
2.4 分子对接预测
通过模拟槲皮素和汉黄芩素这两种有效成分分别与新冠病毒潜在药物靶点ACE2（PDB ID: 1r42）和3CLpro （PDB ID: 6lu7）对接。如图5 所示，槲皮素对ACE2 （结合能为-8.1kJ/mol）和3CLpro （结合能为-6.6 kJ/mol）具有较强的结合能力；
汉黄芩素对ACE2（结合能为-7.7 kJ/mol） 和3CLpro（结合能为-6.7 kJ/mol） 也是如此。对接模式的预测可为药物靶点的进一步研究提供重要参考。
图5 槲皮素、汉黄芩素分别与ACE2 和3CLpro 的分子对接模式Fig. 5 Molecular docking patterns of Quercentin and Wogonin with ACE2 and 3CLpro
根据中医理论，COVID-19 致病因素为湿毒，核心病机为湿毒壅肺、阻遏气机[11]。结合各地不同版本诊疗方案,可以得知COVID-19 的中医治疗原则围绕“湿、热/寒、毒”，注重解表、化湿、清热解毒[17]。目前，苍术在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》中医辨证治疗处方中应用广泛，如寒湿郁肺方、湿热蕴肺方、湿毒郁肺方、寒湿阻肺方、化湿败毒方等[2]。而黄柏、苍术匹配，共奏清热燥湿之效，进而有效改善COVID-19 症状。
本研究用网络药理学的方法系统地分析了二妙方多组分-多靶点-多途径调控COVID-19 疾病的物质基础和潜在作用机制。通过筛选，活性成分中作用最显著的是槲皮素、小檗碱、汉黄芩素。研究表明，槲皮素对SARS-CoV 复制具有明显的抑制作用[18]。WU W 等[19]研究表明，槲皮素对多种流感病毒（H1N1、H3N2）具有抑制作用，阻断其进入细胞内，并对流感病毒的血凝素蛋白存在较高的亲和力，从而抑制病毒引起的溶血反应。另有研究表明，槲皮素可减轻脂多糖对肺成纤维细胞的损害，机制可能是通过下调miR-221 的表达并抑制NF-κB 和JNK通路的激活[20]。小檗碱缓解流感病毒引起的炎症病变，可能是通过线粒体自噬诱导减少ROS 生成，从而限制NLRP3 炎症小体的激活[21]。小檗碱能够明显抑制病毒感染引起的Th1/Th2 和Th17/Treg 比值的升高以及炎性细胞因子的产生[22]。汉黄芩素通过调控NF-κB/MAPK 信号通路来改善完全弗氏佐剂诱导的类风湿关节炎[23]，还能够有效抑制HBV 的复制[24]。
由PPI 网络可知，MAPK1、3、8、14 均属于丝裂原活化蛋白激酶MAPK 家族成员。MAPK 信号通过主要通过细胞外信号调节激酶 （ERK 1/2）、c-jun N 端激酶（JNK）/应急激活的蛋白激酶（SAPK）、P38MAPK、ERK5/BMK1（BMKl）这四种信号传导路径参与细胞生长、分化、凋亡等多种生理过程[25]。MAPK 级联激活是多种信号通路的中心。研究表明，抑制MAPK 信号通路后，可抑制甲型流感的复制，也可通过白介素调节因子的表达，调节机体抗病毒的免疫功能，更能减少细胞氧化应激反应和成纤维细胞增殖影响肺纤维化进程[26]。EGFR 是一种细胞表面糖蛋白，能够介导细胞与细胞、细胞与胞外基质相互黏附。EGFR 的表达是启动炎症反应的关键步骤之一。EGFR 下游的信号转导通路主要有两条：一条是Ras/ Raf/ MEK/ERK-MAPK 通路，而另一条是PI3K/Akt/mTOR 通路。研究表明， 补肺益气方显著抑制慢性阻塞性肺病大鼠的粘液高分泌，可能与调控EGFR/PI3K/mTOR 通路有关[27]。IL-8 主要作用是诱导细胞定向迁移，促进机体发育、组织修复，发挥抗炎、免疫应答、机体免疫应答等过程[28]。有研究认为，COVID-19 感染患者存在的强烈免疫反应和细胞因子风暴是导致重症发展的重要因素，病毒感染诱发了细胞因子风暴，机体失衡的细胞因子系统是造成肺炎及肺损伤的重要原因[29]。黄柏-苍术对于化学趋化因子CXCL8 的调控有助于抑制机体遭受COVID-19 感染引起的炎症因子风暴和过度激活的免疫反应，这对于病毒感染机体诱发的炎症早期的调控较为关键，而在后期可能增强机体免疫力，这种双向调节作用对于改善COVID-19 病毒引起的相关症状具有积极意义。
CASP3、BCL2L1 是细胞凋亡途径中重要的因子，在影响 RNA 病毒的复制以及在治疗肺炎的过程中起关键作用[30]。研究证明病毒在感染时可通过调控外源性死亡受体和内源性线粒体凋亡途径促进自身的复制和增殖，调控凋亡途径中相关基因的表达可能是一种潜在有效的抗病毒方法[31]。
在GO 富集分析的过程中，黄柏-苍术药对干预COVID-19 的生物学途径丰富且复杂。由KEGG 通路富集分析可知，主要涉及VEGF、HIF-1、ErbB、TNF、Toll 样受体等信号通路。临床上COVID-19 重症患者会发展为急性肺损伤，是由肺腔上皮中的炎症单核细胞和巨噬细胞的激活导致促炎细胞因子的释放，包括IL-6、IL-1 和TNF-α，这些因子在免疫性相关肺炎中发挥重要作用[32]。槲皮素是活性成分中的核心成分，研究表明已显示出抑制TNF-α 和NF-κB 的作用[33]。与槲皮素相似，小檗碱、汉黄芩素也可以抑制TNF-α[34]。表皮生长因子受体 （EGFR）是一个巨大的跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体（HER） 家族，该家族由ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4 组成[35]，EGFR 等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。研究表明，抑制ErbB 信号通路可减轻中性粒细胞炎症从而改善慢性阻塞性肺病[36]。此外，VEGF 信号通路与ARDS 的发展有密切关系，VEGF信号通路主要控制人体血管的新生，VEGF 及其受体参与ARDS 的血管渗透性调节导致肺水肿，因此VEGF 也是ARDS 的重要治疗靶点[37]。缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路在在抗病毒、介导能量代谢、炎症反应、血管生成等方面也发挥了重要作用，会引起细胞的缺氧反应，可能与COVID-19 患者普遍缺氧的临床症状相关[38]。
最后，采用分子对接方法对二妙方中主要有效成分作用于ACE2 和3CLpro 的结合能进行了测定，结果显示槲皮素和汉黄芩素对ACE2 和3CLpro 都有良好的结合能力。
本研究运用中药网络药理学的方法，检索出二妙方的活性成分及潜在靶点，以及COVID-19 的相关靶点，得到成分-疾病共同靶点39 个，再对这些靶点进行GO 及KEGG 信号通路富集分析，预测出主要的活性成分小檗碱、槲皮素、汉黄芩素等，主要 通 过 调 节MAPK1、MAPK3、EGFR、CXCL8、CASP3、MAPK8、JAK1、MAPK14、BCL2L1 等靶点，调控TNF、ErbB 等信号通路来减轻过度炎症与免疫反应、抗病毒、调控细胞凋亡、调节肺血管渗透性，减轻肺损伤，从而达到治疗COVID-19 的目的。但其仍具有一定的局限性，有待进一步验证。
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