陈国峰，贾金蓉，李雪茹，廖 辉，张晓波，刘 峰，董见南
（黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所，哈尔滨 150086）
玉米是我国北方地区的主要粮食作物，能够为食品加工提供丰富的原材料，促进我国农业经济的快速发展。玉米生长过程中易发生各种病虫草害，如玉米发苗阶段的主要虫害是黏虫等，心叶阶段的主要有害生物是草地贪夜蛾、玉米螟、蚜虫和红蜘蛛等[1-2]，狗尾草、稗草、藜和反枝苋是玉米生长过程中的主要杂草[3]。
扑草净，又叫扑灭通，是选择性内吸传导型除草剂，其主要被根部吸收，在植物体内运输传导到植物叶片，也可从茎叶进入植物体内[4-5]。扑草净作用机理是抑制植物光合作用中电子的传递。杂草中毒症状首先是叶片由外向内逐渐失绿，最终全株枯死[6-8]。乙草胺属于芽前除草剂，由美国孟山都公司于1971年研发成功，是目前世界上最重要的除草剂品种之一，也是目前我国使用量最大的除草剂之一，可防除一年生禾本科杂草和某些一年生阔叶杂草[9-10]。乙草胺作用机理是抑制α-淀粉酶活性，影响赤霉素、蛋白酶的合成及细胞膜通透性等[11-12]。异 唑草酮是一种选择性内吸型苗前除草剂，主要用于玉米、甘蔗等旱作物，可防除多种一年生阔叶杂草和一些禾本科杂草[13]。异 唑草酮被喷到土壤中后迅速水解为异 唑草酮代谢物（异 唑草酮-二酮腈）[14]。异 唑草酮-二酮腈通过抑制对羟基苯基丙酮酸酯双氧化酶的合成，进而影响到类胡萝卜素的生物合成，最终使杂草出现失绿、生长停止和坏死等症状[14]。将扑草净、乙草胺和异 唑草酮复配，可扩大复配药剂对春玉米田一年生杂草的杀草谱及提高防效。
大量研究报道了扑草净、乙草胺和异 唑草酮的药效、环境行为以及检测方法等[15-18]，而目前有关同时测定青玉米、玉米、青玉米秸秆和玉米秸秆中扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈残留方法的研究较少。此外，有关田间条件下联合处理扑草净、乙草胺和异 唑草酮及其代谢物的残留和风险评估的报道较少。因此，本研究的目的是：（1）建立一种简单、快速、有效的分析方法，通过UPLC-MS/MS测定青玉米、玉米、青玉米秸秆和玉米秸秆中扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的残留量；
（2）研究田间施用78%扑草净·乙草胺·异 唑草酮SE在青玉米、玉米、青玉米秸秆和玉米秸秆中的最终残留；
（3）评估扑草净、乙草胺和异 唑草酮在膳食中的摄入风险。
1.1 材料与仪器
标准品扑草净（纯度99.7%）、乙草胺（纯度99.4%），上海市农药研究所有限公司；
异 唑草酮（纯度99.6%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；
异 唑草酮-二酮腈（纯度99.5%），美国CHEM SERVICE公司。乙腈、丙酮和乙酸铵均为色谱纯、有机系滤膜（0.22μm），北京迪马欧泰科技发展中心；
乙腈、氯化钠均为分析纯，北京益利精细化学品有限公司；
石墨化碳黑（GCB）、N-(正丙基)乙二胺（PSA），天津艾杰尔科技有限公司。
X-TQS三重四极杆质谱，配有电喷雾离子源（ESI），美国沃特世公司；
BT 2202 S电子天平，德国赛多利公司；
CF15RX高速离心机，日本日立公司；
HS501振荡器，德国艾卡公司。
1.2 试验方法
1.2.1 田间试验
按照NY/T 788—2018《农产品中农药残留试验准则》[19]分别于我国6处玉米主产区进行残留试验。试验地的气候条件及土壤类型见表1。各地的残留试验设2个试验小区（1个处理小区和1个对照小区），每个小区面积为100 m2，小区之间设保护行。于春玉米播种后，出苗前以2 340 g a.i./hm2施用1次78%扑草净·乙草胺·异 唑草酮悬乳剂，于青玉米成熟期和玉米成熟期分别收获青玉米、青玉米秸秆和玉米、玉米秸秆。
表1 试验地气候条件及土壤类型
1.2.2 样品采集与制备
于青玉米和玉米成熟期在试验小区中按照棋盘式分布采样，每个小区采集不少于12株，采集的样品总量不少于2 kg，并将采集完的样品装入样本容器。处理小区分别采集2个独立样品，对照小区采集1个样品。地头或边缘0.5 m内不采样。
将采集的青玉米秸秆和玉米秸秆样品剪切成1 cm以下的小段，充分混匀，用四分法缩分样品，分取2份200 g样品，于低温（-18℃）保存。青玉米和玉米样品脱粒后以四分法缩分，分取2份200 g样品，于低温（-18℃）保存。试验前用磨粉机将青玉米、青玉米秸秆、玉米和玉米秸秆样品制成粉末状样品。
1.2.3 标准溶液的配制
分别称取扑草净、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的标准品各10 mg至10 mL烧杯中，加乙腈溶解并用10 mL容量瓶定容，配制成浓度为1 000 mg/L的标准储备液。称取乙草胺标准品10 mg至10 mL烧杯中，加丙酮溶解，并用10 mL容量瓶定容，配制成浓度为1000mg/L的标准储备液。将上述浓度为1000 mg/L扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的标准储备液用乙腈稀释配得100 mg/L的标准混合液，随后再用乙腈逐级稀释配制成0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的系列混合标准工作溶液，于4℃保存，待用。
1.2.4 样品前处理
分别称取10.0 g青玉米、10.0 g玉米、5.0 g青玉米秸秆和5.0 g玉米秸秆于50 mL离心管中，依次加入适合比例的乙腈提取剂，振荡30 min，随后加入5 g NaCl，涡旋10 min，以3 500 r/min离心5 min，待净化。
取1 mL上层乙腈相转移至含有吸附剂的离心管中，涡旋30 s，以10 000 r/min离心3 min，取上清液，经0.22μm有机系滤膜过滤，待测。
1.2.5 仪器条件
色谱条件。利用配备超高效液相色谱（I-Class，Waters）的三重四极杆串联质谱仪（UPLC-MS/MS）对扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈进行分析。Acquity UPLC BEH T3（100 mm×2.1 mm，1.8μm）用于液相色谱分离，柱温为35℃，进样体积为5μL，流速为0.3 mL/min。流动相由5 mmol/L乙酸铵水溶液（A）和乙腈（B）的混合溶剂组成。采用梯度洗脱，洗脱程序：0～1 min，10%B；
1～2.0 min，10%～90%B；
2.0～3.0 min，90%B；
3.0～3.5 min，90%～10%B；
3.5～5.0 min，10%B。
质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）；
扑草净和乙草胺的扫描方式：正离子扫描，异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的扫描方式：负离子扫描；
毛细管电压：3.0 kV；
离子源温度：150℃；
脱溶剂温度：450℃；
脱溶剂气流量：1000L/h；
锥孔气流量：150L/h；
检测方式：多重反应监测（MRM），详见表2。
表2 扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的质谱参数
1.2.6 除草剂检测方法优化
优化提取溶剂。用混合标准溶液加标青玉米、玉米、青玉米秸秆和玉米秸秆，使上述4种基质中除草剂及代谢物的含量均为0.1 mg/kg；
分别对扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的提取溶剂纯乙腈、乙腈∶水（20∶20，V/V）、乙腈∶水（20∶10，V/V）进行优化筛选。
优化净化条件。取上层乙腈提取液1 mL，加入至25～100 mg常用的吸附剂PSA、GCB和C18中，评估其使用量并选用最适材料。
1.2.7 定量限和检测限
以3倍的信噪比（S/N）来确定目标化合物的检测限（LOD），以最小添加回收浓度作为方法的定量限（LOQ）。为了确定青玉米、玉米、青玉米秸秆和玉米秸秆中的扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的LOQ值，用工作溶液0.01 mg/L加标4种样品，按照上述方法进行提取和净化，逐级稀释直至目标化合物的S/N比为10（S/N=10）。
1.2.8 添加回收测定
将混有扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的标准溶液分别添加3组浓度到空白玉米、青玉米、玉米秸秆和青玉米秸秆样品中，每档浓度重复5次，用上述分析方法测定并计算相对标准偏差（RSD）。
1.3 数据处理
扑草净、乙草胺和异 唑草酮的国家估算每日摄入量（NEDI）和风险商（RQ）按式（1）、（2）计算[20]。
式中：STMRi为农药在某种食品中的规范残留试验中值，mg/kg；
Fi为一般人群对该食品的消费量，kg；
bw为中国人均体重，kg（一般以63 kg计）；
ADI为农药的每日允许摄入量mg/(kg bw)。
当RQ≤100%时，表示其风险可以接受，RQ值越小，风险越小；
当RQ＞100%时，表示有不可接受的慢性风险，RQ值越大，风险越大。
2.1 提取与净化
2.1.1 提取剂的选择
提取剂的选择如图1所示，使用纯乙腈对扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈在青玉米、玉米、青玉米秸秆和玉米秸秆中的平均提取率在50.9%～72.6%，乙腈∶水（20∶20，V/V）的平均提取率在74.3%～83.2%，乙腈∶水（20∶10，V/V）对上述4种化合物的平均提取率在92.3%～102.2%。因此，乙腈∶水（20∶10，V/V）是提取青玉米、玉米、青玉米秸秆和玉米秸秆中扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的最佳溶剂。
图1 扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的提取率
2.1.2 净化剂的选择
根据优化试验结果，使用30 mL乙腈∶水（20∶10，V/V）提取目标化合物。如表3所示，每1 mL提取物中的C18含量在25～100 mg时，扑草净、乙草胺、异唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的平均回收率低于86.7%；
每1 mL提取物中的PSA含量在25～75 mg时，平均回收率介于84.2%～103.2%，可能因PSA净化剂含有2个氨基，可与提取液中有机酸、脂肪酸、色素、糖类等极性基质成分结合，且对目标农药和代谢物不具有吸附效果，当PSA使用量超过50 mg时，4种化合物的平均回收率均下降；
每1 mL提取物中的GCB含量在25～100 mg时，平均回收率在41.2%～87.1%，随着GCB使用量的增加，其回收率逐渐减小，说明GCB与目标化合物之间具有强吸附性。
表3 不同净化剂对4种化合物的净化效果对比
考虑到样品回收率和净化的成本，故本次试验使用50 mg PSA净化青玉米、玉米中的杂质。对于秸秆样品，本次试验使用25 g GCB进行净化，原因在于其有着特殊的层状结构，能够吸附秸秆提取液中的色素和甾醇类物质，且25 mg GCB不会吸附目标化合物。
2.2 方法验证
如表4所示，在0.001～0.5 mg/L范围内，扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈标准溶液浓度与峰面积呈良好的线性关系，R2均大于0.999。
在上述条件下，扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的检测限（LOD）分别为1.1×10-5、1.1×10-5、4.8×10-6、1.1×10-5ng（表4）。以最小添加回收浓度作为方法的定量限，在上述色谱条件下扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈在玉米中的定量限（LOQ）分别为0.01、0.005、0.005和0.005 mg/kg；
在青玉米中的最低检出浓度均为0.005 mg/kg，在玉米秸秆中的最低检出浓度均为0.02 mg/kg，在青玉米秸秆中的最低检出浓度分别为0.02、0.02、0.02和0.01 mg/kg（表5）。
表4 扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的标准曲线和LOD
表5 扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的添加回收试验结果（n=5）
玉米中扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的平均回收率为75.5%～108.4%，RSD值为2.9%～12.7%；
青玉米中扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的平均回收率为82.6%～105.3%，RSD值为1.7%～13.6%；
玉米秸秆中上述除草剂及代谢物的平均回收率为86.7%～110.8%，RSD值为1.9%～14.0%；
青玉米秸秆中除草剂及代谢物的平均回收率为86.9%～107.8%，RSD值为0.8%～14.4%。结果表明，该方法的精密度、重现性和灵敏度足以满足同时定量测定玉米、青玉米、玉米秸秆和青玉米秸秆中除草剂及代谢物的残留量。
2.3 玉米中扑草净、乙草胺和异 唑草酮的最终残留量及膳食暴露风险评估
如表6所示，玉米、青玉米、玉米秸秆和青玉米秸秆中扑草净的残留量均未检出，低于GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[21]规定的玉米中扑草净最大残留限量（MRL）（0.02 mg/kg）；
乙草胺在上述4种基质中也均未检出，低于标准规定的MRL（0.05 mg/kg）；
异 唑草酮和异 唑草酮代谢物在上种4种基质中也均未检出。
表6 玉米、青玉米、玉米秸秆、青玉米秸秆中扑草净、乙草胺和异 唑草酮的最终残留量
为了准确评估NEDI，应考虑中国的饮食摄入方式以及在中国注册并使用扑草净、乙草胺、异 唑草酮的农作物及其在各国的相应最大残留限量。表7列出了我国国民对部分食物的膳食量（Fi）。按照中国、CAC、美国、欧盟、澳大利亚、韩国、日本的顺序选择最大残留量（MRL）[22]。此外，在计算相应的NEDI时，仅选择确保给定食品中NEDI最高的参考残留限量。根据不同食品的残留数据得出扑草净的总NEDI为0.048 2 mg/(kg bw)，RQ为1.91%；
乙草胺的总NEDI为0.023 0 mg/(kg bw)，RQ为3.65%；
异唑草酮的总NEDI为0.000 437 mg/(kg bw)，RQ为0.035%。
表7 玉米中扑草净、乙草胺、异 唑草酮的膳食风险评估结果
本文结合了改良的QuEChERS方法和UPLCMS/MS检测技术，同时定量测定玉米、青玉米、玉米秸秆和青玉米秸秆中扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的残留量。该方法检测的基质更为广泛，涵盖了春玉米生长的全过程，且具有回收率高，准确性高和可重复性强等优点。所提出的方法适用于监测田间和市场上的玉米、青玉米、玉米秸秆和青玉米秸秆中的扑草净、乙草胺、异 唑草酮和异 唑草酮-二酮腈的残留量。在田间条件下，施用复配药剂78%扑草净·乙草胺·异 唑草酮SE后，玉米、青玉米、玉米秸秆和青玉米秸秆中扑草净、乙草胺和异 唑草酮的最终残留量均未检出，低于其相应规定。玉米中扑草净、乙草胺和异 唑草酮的膳食风险评估结果显示，成熟期收获的玉米RQ值均低于100%。这些数据表明，玉米播种后，出苗前以2 340 g a.i./hm278%扑草净·乙草胺·异 唑草酮SE对土壤喷施1次，不会对健康造成潜在的危害。本研究为在玉米上合理使用扑草净、乙草胺和异 唑草酮的复配农药提供了数据支撑，并为玉米食用安全性的初步评估提供参考。
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