郭献平，郭鹏，王东升，蒋卉，吴中营，韩永平，智梦茹
（1 河南省农业科学院园艺研究所，郑州450002）（2 河南农业大学园艺学院）
铁是参与植物体内氧化还原反应的重要元素，与叶绿素合成和光合作用密切相关。在干旱、半干旱的石灰性土壤上，pH 值较高，富含游离碳酸钙，作物缺铁现象非常普遍[1-2]。在不同地区，东方梨和西洋梨均有报道梨树缺铁黄化病[3-6]。缺铁会导致梨树叶片叶绿素含量下降，叶脉间萎黄，降低光合作用，果实产量降低，甚至树体死亡[7-8]。生产上通常施用各种铁肥矫治梨树缺铁黄化病，包括无机铁肥、螯合铁肥、有机复合铁肥等[9]。采用的方式有土壤施用、叶面喷施及树干注射等[10]。土施方面，在石灰性土壤上施可溶性无机铁肥（如FeSO4·7H2O），因氧化作用及土壤碱性作用最终会转化为氢氧化铁，即使增加铁肥施用量，其效果仍不是很理想[11]；
有机复合铁肥（如木质素磺酸铁）虽然易降解，但矫治作物缺铁的效果不如螯合铁肥。螯合铁肥一般源于对铁有高度亲和力的有机酸与无机铁盐中Fe3+螯合而成，常见螯合剂如乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙三胺五乙酸（DTPA）、乙二胺二邻羟苯基乙酸（EDDHA）等[9]。研究表明，螯合剂螯合铁的能力与pH 值相关性强，随着溶液pH 值增高，螯合能力从小到大依次为EDTA、DTPA、EDDHA。pH 值高于6.7，铁可从Fe-EDTA 中被置换，pH 值高于7.7，铁可从Fe-DTPA 中被置换，而Fe-EDDHA 几乎不受pH 值影响[12]。因此，EDDHA 被广泛作为生产螯合铁肥的螯合剂。
目前，土施Fe-EDDHA 在柑橘[13]、桃[14]、猕猴桃[15]等果树上均有防治缺铁黄化病的应用。在石灰性土壤条件下，土施Fe-EDDHA 在梨树上的应用较少。本研究以5 年生缺铁黄化新高梨和1 年生水培黄化杜梨苗为研究对象，土施不同用量无机铁肥FeSO4·7H2O 和螯合铁肥（Fe-EDDHA），果实成熟时测定新高梨叶片叶绿体色素、微量元素含量和果实品质，并通过在水培黄化杜梨苗溶液中加入FeSO4·7H2O 和螯合铁肥（Fe-EDDHA），测定杜梨叶片叶绿素含量和光合指标、根系活性铁等微量元素含量及铁吸收关键基因的表达量变化，探究Fe-EDDHA 矫治梨树缺铁黄化病的应用效果，及其促进梨树复绿的机理。
1.1 试验材料
试材为5 年生缺铁黄化新高梨和1 年生水培黄化杜梨苗。5 年生结果初期新高梨种植于河南省兰考县谷营镇霍寨村梨园，砧木为杜梨，面积约3 hm2，南北行向，行株距4 m×2 m，树高2.6 m，主干粗6.2 cm。园区土壤为沙壤土，pH 值8.7，有机质含量0.9%，碱解氮含量46.8 mg/kg，有效磷含量16.6 mg/kg，速效钾含量138.1 mg/kg，有效铁含量8.4 mg/kg，CaCO3含量114.90 g/kg，HCO3-含量0.32 g/kg。
杜梨幼苗种植在河南现代农业研究开发基地梨示范园温室大棚内，当幼苗长出5～7 片真叶后，选择高度均一的幼苗移至水培槽培养，营养液为含1×10-4mol/L Fe-EDTA［A600437，生工生物工程（上海）股份有限公司］的改良Hoagland 营养液，pH 值约6.5[16]。1 周后，移至加有2 mmol/L NaHCO3、0.5 g/L CaCO3、1×10-6mol/L Fe-EDTA 的100 L 改良Hoagland 营养液中，pH 值7.5 左右，模拟石灰性土壤条件，培养30 d 获得杜梨黄化苗[17]。
1.2 试验方法
1.2.1 试验处理
5 月新高梨出现缺铁黄化病后，选择黄化程度基本相同、树势一致、有代表性的梨树作为试材。试验采用土施无机铁肥［FeSO4·7H2O，生工生物工程（上海）股份有限公司］和螯合铁肥（Fe-EDDHA含量＞6%，四川瑞隆螯合肥科技有限公司）的方法，设置5 个处理：T1，株施无机铁肥（FeSO4·7H2O）5 g；
T2，株施无机铁肥（FeSO4·7H2O）15 g；
T3，株施螯合铁肥（Fe-EDDHA）5 g；
T4，株施螯合铁肥（Fe-EDDHA）15 g；
以不施铁肥为对照（CK1），每个处理3 株树。处理方法是在距离主干50 cm 挖宽15～20 cm 的环状沟，用10 L 灌溉水溶解铁肥后均匀地浇入沟内，渗完后用土回填，对照用同等量的水。2 周后，按照同样方法和用量再施1 次。最终，T1、T2 处理分别株施无机铁肥（FeSO4·7H2O）10、30 g，T3、T4 处理分别株施螯合铁肥（Fe-EDDHA）10、30 g。处理125 d 果实成熟时，测定叶片叶绿体色素、微量元素含量，各指标每株选取代表性叶片3 片混合测定；
从每株树不同方位选取6 个果实测定果实品质。
选择长势、黄化程度相近的杜梨苗移至20 L 不同铁肥的Hoagland 营养液中，设置3 个处理：T5、T6 分别是含1×10-6mol/L FeSO4·7H2O、1×10-6mol/L Fe-EDDHA 的Hoagland 营养液；
对照（CK2）是含1×10-6mol/L Fe-EDTA 的原营养液。3 个处理营养液中均含2 mmol/L NaHCO3和0.5 g/L CaCO3，每个处理6株，共处理15 d。选择3个处理初始SPAD值相近的叶片10片，每隔5 d 测定叶片SPAD 值；
15 d 后测定叶片光合指标，并取部分根系转至液氮中速冻，置于-80 ℃冷冻保存备用，剩余根系测定微量元素。
1.2.2 测定指标与方法
每个处理称取0.2 g 剪碎的新高梨叶片，用96%乙醇提取，用上海佑科UV756 紫外可见分光光度计测定叶绿体色素提取物在665、649、470 nm 处的吸光度值，以96%乙醇为空白，测定总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量，参照Lichtenthaler等[18]的方法计算。杜梨叶片SPAD 值利用SPAD-502便携式叶绿素测定仪测定。
活性铁、活性铜、活性锌、活性锰含量采用酸消解ICP 法测定[19-20]。新高梨叶片或杜梨根系在105 ℃杀青30 min，然后在70 ℃条件下烘干7 d至恒重后，称取干燥叶片或根系0.1 g，加入10 mL的1.0 mol/L 盐酸浸提，连续振荡24 h，过滤后用ICP法测定浸提液中的活性铁、活性铜、活性锌、活性锰含量。
取新高梨叶片0.5 g 于瓷坩埚中，在电炉中低温碳化（至不冒烟），再移至高温电炉中缓缓升温，至500 ℃灼烧2～3 h，冷却后用10～20 mL 盐酸溶液溶解灰分，并定容至25 mL，用ICP 法测定浸提液中全硼、全铜、全锌、全锰含量。
用天平称量单果重，用托普云农GY-4 硬度计测定果肉硬度，用Atago PAL-1 数显糖度计测定可溶性固形物含量，可滴定酸含量按照GB 12456—2021 的方法测定，维生素C 含量按照GB 5009.86—2016 的2,6-二氯靛酚滴定法测定，并计算固酸比。
采用汉莎光合作用测定仪（CIRAS-3）测定叶片光合指标，包括净光合速率（Pn）、胞间CO2浓度（Ci）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）和水分利用率（WUE）。
在NCBI 中获得杜梨三价铁还原酶基因PbFRO2和二价铁转运蛋白基因PbIRT1cDNA 全长的基础上，利用Primer 5.0 设计实时荧光定量PCR引物，以Actin为内参基因，PbActinQ-F：5′-CTTCCC GATGGCCAAGTCAT-3′，PbActinQ-R：5′-CATGAAT GCCAGCAGCTTCC-3′，PbFRO2Q-F：5′-CTCTTCG GTTCTGGCACTGT-3′，PbFRO2Q-R：5′-GGCCATG AGCTGTGAAGAGT-3′，PbIRT1Q-F：5′-GCCAAGGG AGAAAACGGAGA-3′，PbIRT1Q-R：5′-AGCGCAG CTACAAGACCTTT-3′。引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
将-80 ℃保存的杜梨幼苗根系取出，用总RNA提取试剂盒R1200（北京索莱宝科技有限公司）提取总RNA，用Thermo Fermentas反转录试剂盒K1622（美国）反转录获得cDNA。实时荧光定量PCR 反应体系参照南京诺唯赞生物科技有限公司的SYBR Green Master Mix 试剂盒，反应程序：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，40 个循环。采用2-△△CT法进行表达量分析。
1.3 数据分析
采用SPSS 22.0 进行统计学分析，用Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析，利用Excel 进行数据处理和作图。
2.1 不同处理对新高梨叶片叶绿体色素含量的影响
由表1 可知，施用铁肥125 d后，新高梨叶片总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素含量由高到低均为T4＞T3＞T2＞T1＞CK1，其中T1 和T2 处理的叶片总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量与CK1 均无显著差异；
T3 处理的叶片部分复绿，其总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量分别较CK1 显著增加了98.0%、94.7%、108.3%、92.3%；
T4 处理的叶片完全复绿，其总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量分别较CK1 显著增加了542.0%、521.1%、608.3%、423.1%。此外，T2 处理的叶绿素a、类胡萝卜素含量与T3 处理均无显著差异，总叶绿素、叶绿素b含量均显著低于T3 处理。T4 处理的叶绿体色素含量均显著高于T1、T2 和T3 处理。
表1 不同处理新高梨叶片叶绿体色素含量 mg/g
2.2 不同处理对新高梨叶片微量营养元素的影响
施用铁肥125 d后，各处理叶片活性铁含量由高到低为T4＞T3＞T2＞T1＞CK1，而叶片全硼、全铜、全锌含量与活性铁相反，叶片全锰含量由高到低为T1＞CK1＞T2＞T3＞T4。T2、T3、T4 处理的叶片活性铁含量分别比CK1 显著提高了75.6%、148.9%、251.4%，T1 处理与CK1 无显著差异。T2、T3、T4 处理的叶片全硼、全锰含量分别比CK1 显著降低了21.3%、33.3%、39.3%和7.7%、9.9%、33.7%，T1 处理与CK1 均无显著差异，T2 和T3 处理间均无显著差异。4 个铁肥处理的叶片全铜、全锌含量均显著降低，分别较CK1 降低了10.2%、34.8%、44.1%、50.4%和8.0%、24.9%、35.9%、38.1%，T3 和T4 处理间均无显著差异（表2）。
表2 不同处理新高梨叶片微量营养元素含量
2.3 不同处理对新高梨果实品质的影响
由表3 可以看出，T1、T2 处理的单果重、果肉硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、固酸比和维生素C 含量与CK1 均无显著差异。T3 处理的可溶性固形物含量、固酸比分别较CK1 显著提高了7.9%和13.5%，单果重、果肉硬度、可滴定酸含量和维生素C 含量与CK1 均无显著差异。T4 处理的单果重、可溶性固形物含量、固酸比分别较CK1 显著提高了22.1%、15.3%和38.2%，果肉硬度、可滴定酸含量分别较CK1 显著降低了8.9%和15.9%，维生素C 含量与CK1 无显著差异。T1、T2 处理的单果重、果肉硬度、可滴定酸含量、固酸比和维生素C 含量与T3 处理均无显著差异，可溶性固形物含量显著低于T3 处理。
表3 不同处理新高梨果实品质
2.4 不同处理对杜梨叶片SPAD 值的影响
如图1 所示，杜梨幼苗在模拟石灰性土壤条件的Hoagland 营养液中处理15 d 期间，CK2 的叶片SPAD 值呈下降趋势，T5 处理的叶片SPAD 值与CK2相比无显著变化。T6 处理的叶片SPAD 值呈上升趋势，且在处理前5 d 上升幅度最大，第5、10、15 d的SPAD 值均显著高于T5 处理和CK2。在处理第15 d时，T6 处理的叶片已复绿，其SPAD 值较T5 处理显著提高了113.7%，较CK2 显著提高了146.6%。
图1 不同处理不同时期杜梨叶片SPAD值
2.5 不同处理对杜梨叶片光合指标的影响
由表4 可以看出，杜梨幼苗水培处理15 d后，T5 处理的叶片净光合速率（Pn）、水分利用率（WUE）与CK2 均无显著差异，胞间CO2浓度（Ci）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）均显著低于CK2。T6 处理的Pn、WUE 分别较CK2 显著提高了1 034.5%和2 876.9%，分别较T5 处理显著提高了528.7%、800.0%；
T6 处理的Ci 显著低于CK2和T5 处理，Gs、Tr 均显著低于CK2，但与T5 处理无显著差异。
表4 不同处理杜梨叶片光合特性
2.6 不同处理对杜梨根系微量营养元素的影响
水培处理15 d后，各处理杜梨根系活性铁含量由高到低为T6＞T5＞CK2，而活性铜、活性锌、活性锰含量与活性铁含量相反。T5、T6 处理杜梨根系活性铁含量分别比CK2 显著提高了71.4%、266.0%，且T6 处理根系活性铁含量比T5 处理显著提高了113.6%。T6 处理的活性铜、活性锌、活性锰含量分别较CK2 显著降低了76.2%、53.3%和57.5%。T5处理的活性铜含量显著低于CK2，但其活性锌、活性锰含量与CK2 均无显著差异（表5）。
表5 不同处理杜梨根系微量营养元素含量
2.7 不同处理对铁吸收关键基因表达量的影响
由图2 可知，水培处理15 d后，各处理杜梨根系铁吸收关键基因PbFRO2和PbIRT1的表达量由高到低均为T5＞T6＞CK2，且差异均显著。T5 处理的PbFRO2相对表达量分别是CK2和T6处理的29.1倍和5.3倍，T6 处理是CK2 的5.4 倍。T5 处理的PbIRT1相对表达量分别是CK2 和T6 处理的349.0倍和3.3倍，T6 处理是CK2 的105.5 倍。
图2 不同处理第15 d 杜梨根系铁吸收关键基因表达量
目前，石灰性土壤面积占世界陆地总面积的30%以上[21]。我国的石灰性土壤分布很广，约占耕地面积的一半[22]。因此，解决石灰性土壤引起的梨树缺铁黄化病具有重要意义。农业行业标准NY/T 1615—2008 中石灰性土壤中CaCO3含量≥10 g/kg。由于的存在，石灰性土壤铁离子会以Fe2O3的形式被固定[23]。在本研究中，新高梨园区土壤为石灰性土壤，其有效铁含量仅为8.4 mg/kg，有效铁含量偏低[24]，从而导致新高梨出现缺铁黄化病。
本研究中，施用铁肥125 d后，T4 处理［株施螯合铁肥（Fe-EDDHA）15 g＋2 周后株施螯合铁肥（Fe-EDDHA）15 g］的新高梨叶片完全复绿，叶片总叶绿素含量和活性铁含量分别比对照提高了542.0%和251.4%，单果重和可溶性固形物含量分别比对照提高了22.1%和15.3%；
T3 处理［株施螯合铁肥（Fe-EDDHA）5 g＋2 周后株施螯合铁肥（Fe-EDDHA）5 g］的叶片未能完全复绿，叶片总叶绿素含量和活性铁含量分别比对照高98.0%和148.9%，可溶性固形物含量比对照高7.9%；
T1 和T2 施用无机铁肥（FeSO4·7H2O）处理的效果较差，这与Fe-EDDHA 矫治桃和秦美猕猴桃失绿的研究结果一致[14-15]。不同树种和同一树种不同树龄或者冠幅对铁元素的需求量不同，造成了黄化果树复绿所需的Fe-EDDHA 用量不同。另外，本研究是在出现缺铁黄化症状之后间隔2 周各施用1 次螯合铁肥（Fe-EDDHA），而桃树是在刚萌芽后、猕猴桃在幼叶刚出现时施用，柑橘在春梢始长期和谢花后1周各施用1次[13]。因此，在梨幼树期、结果初期、盛果期等不同树龄或者冠幅矫治缺铁黄化病施用Fe-EDDHA 的用量、次数以及施用的最佳时期还有待进一步研究。
本研究通过在水培黄化杜梨苗的溶液中加入无机铁肥（FeSO4·7H2O）和螯合铁肥（Fe-EDDHA），进一步探究Fe-EDDHA 促进梨树复绿的机理。在模拟石灰性土壤条件的溶液中加入Fe-EDDHA 处理15 d后，杜梨叶片SPAD 值和活性铁含量分别比对照显著提高了146.6%和266.0%，而FeSO4·7H2O作用效果较差，与本研究中新高梨应用效果相同。杜梨根系采用机制Ⅰ吸收铁[25]，本研究T5 处理（1×10-6mol/L FeSO4·7H2O）PbFRO2和PbIRT1的相对表达量分别为T6处理（1×10-6mol/L Fe-EDDHA）的5.3 倍和3.3倍，说明与T6 处理相比，T5 处理还处在缺铁状态，导致其铁吸收关键基因的相对表达量较高。植物在缺铁胁迫后PbFRO2和PbIRT1的相对表达量会呈现先升高后降低的趋势[16,26]，CK2在获得杜梨黄化苗时缺铁处理30 d，在测定基因相对表达量时已缺铁处理45 d，这可能是CK2 的2 个铁吸收关键基因表达量较T5 和T6 处理低的原因。
缺铁条件下二价铁转运蛋白基因IRT表达量升高，不仅增强转运铁的效率，同时也提高了转运锌和锰等二价金属离子的能力，缺铁胁迫下，拟南芥根系中锌和锰含量均显著提高[27]。本研究中，缺铁条件下，对照和施用无机铁肥（FeSO4·7H2O）处理的新高梨叶片全硼、全铜、全锌、全锰含量与杜梨根系活性铜、活性锌、活性锰含量均高于施用螯合铁肥（Fe-EDDHA）处理，与张林森等[14]研究结果基本一致。
综上所述，梨树结果初期出现缺铁黄化症状之后，株施螯合铁肥（Fe-EDDHA）15 g＋2 周后株施螯合铁肥（Fe-EDDHA）15 g 能够有效提高石灰性土壤上梨树叶片活性铁含量和叶绿体色素含量，提升果实品质，矫治缺铁黄化病。
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