张莉，蒋丽琼，马钧，钟桥(南京医科大学附属苏州医院 .医学检验科,.肾内科，江苏苏州 215002)
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是主要的糖尿病微血管并发症之一。全世界新诊断为T2DM的患者中约有3%在诊断时已经有明显的肾病，约有20%～30%在晚年出现此类并发症[1]。尽管DN的发生发展受多种因素影响，但早期诊断后经治疗大多可延缓DN进展。肾活检作为DN早期诊断的“金标准”，因其侵创性，临床应用受限[2]。因此，DN早期诊断标志物对于延缓疾病进展具有重要意义。鉴于此，本研究拟围绕血清和尿液肾功能标志物，对T2DM、早期DN组以及临床DN组进行比较，探讨尿液和血清肾功能指标对DN早期诊断的价值，并构建早期DN风险评估列线图模型。
1.1研究对象 选取南京医科大学附属苏州医院2019年1月至2021年12月收治的873例2型糖尿病(T2DM)患者，男456例，女417例；
根据尿微量清蛋白与肌酐比值(urinary microalbumin-creatinine ratio，umACR)进行分组：T2DM组，umACR<30 mg/g；
早期DN组(DN1组)，30 mg/g≤umACR≤300 mg/g；
临床DN组(DN2组)，umACR>300 mg/g。DN诊断标准参照《中国糖尿病肾脏病防治指南(2021年版)》[3]。排除标准：排除有糖尿病急性并发症、妊娠、炎症、恶性肿瘤、泌尿系统疾病、自身免疫病、急慢性感染性疾病、长期应用糖皮质激素及其他类型肾病等。本研究经医院伦理委员会批准(批准文号：K2020-042-H01)。
1.2主要仪器与试剂 7600全自动生化分析仪(日本日立公司)；
BNⅡ特定蛋白仪(德国西门子公司)；
葡萄糖(glucose，Glu)、尿素(Urea)、肌酐(creatinine，Cr)、尿酸(uric acid，UA)试剂盒(日本日立公司)；
糖化清蛋白(glycosylated albumin，GA)试剂盒(日本旭化成制药株式会社)；
尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(urinary N-acetyl-β-D glucosaminidase，uNAG)试剂盒、血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C，CysC)试剂盒(北京利德曼公司)；
尿微量清蛋白(urinary microalbumin，umAlb)、尿α1-微球蛋白(urinary α1-Microglobulin，uα1-MG)、尿β2微球蛋白(urinary β2-Microglobulin，uβ2-MG)、尿免疫球蛋白G(urinary immunoglobulin G，uIgG)、尿转铁蛋白(urinary transferrin，uTrF)试剂盒(德国西门子公司)。
1.3标本采集与检测 所有研究对象空腹12 h后采集静脉血，室温静置30 min，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min分离血清，2 h内完成检测。所有研究对象均留取晨起清洁中段尿10 mL，2 000 r/min离心20 min，收集上清液，2 h内完成检测。不能及时检测的标本离心后，4 ℃放置不超过24 h。
采用7600全自动生化分析仪检测血清Glu(己糖激酶法)、GA(酶法)、Urea(尿素酶法)、UA(尿酸酶法)、Cr(肌酐酶法)、CysC(免疫比浊法)、uNAG(连续监测法)。采用BNⅡ特定蛋白仪用免疫散射比浊法检测umAlb、uα1-MG、uβ2-MG、uIgG和uTrF。操作均遵循本室标准操作规程。根据慢性肾脏病流行病合作组(chronic kidney disease epidemiology collaboration，CKD-EPIsCr/CysC)公式[4]，估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)。
2.1患者的一般资料 见表1。除外性别和Glu，3组患者年龄、GA、Urea、Cr、UA、CysC和eGFR差异均有统计学意义(P均<0.05)。与T2DM组比较，其他2组患者年龄、Urea、UA和CysC水平升高，eGFR水平降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)；
与DN1组比较，DN2组Urea、Cr、UA和CysC水平升高，eGFR水平降低，差异均有统计学意义(P均<0.05)；
T2DM组与DN1组Cr差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 3组患者一般资料比较
2.2尿液肾功能指标比较 见表2。除外uNAG，3组患者umACR、umAlb、uα1-MG、uβ2-MG、uIgG和uTrF水平：DN2组>DN1组>T2DM组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。
表2 3组患者尿肾功能指标比较
2.3各指标对早期DN诊断价值的ROC曲线分析 以早期DN患者作为疾病组，T2DM组作为对照组，绘制除umACR和umAlb之外的其他指标评估早期DN诊断价值的ROC曲线，计算约登指数最大时各指标的截断值。结果提示，血清CysC和eGFR的AUCROC分别为0.626和0.622；
尿液中以uTrF的AUCROC最高，为0.868，其次是uIgG。当6个指标联合时，AUCROC达到最大值，为0.904，当CysC+uIgG+uTrF联合时AUCROC为0.893。见图1和表3。
图1 uTrF、uIgG和CysC单独及其联合检测诊断DN的ROC曲线
表3 各检测指标对DN患者的ROC曲线分析
2.4各检测指标的相关性分析 uα1-MG、uβ2-MG、血清CysC、uIgG、uTrF和umAlb与umACR呈正相关，r依次为0.47、0.35、0.44、0.73、0.87和0.89，P均<0.001；
uα1-MG、uβ2-MG、血清CysC、uIgG、uTrF和umAlb与eGFR呈负相关，r依次为-0.42、-0.29、-0.82、-0.36、-0.34、-0.37，P均<0.001。
2.5DN的多因素Logistic逐步回归分析 以DN=1，T2DM=0分组作为因变量，通过多因素逐步Logistic回归对上述指标进行单因素分析，将有统计学意义的指标作为自变量纳入多因素回归分析。年龄按照≤45岁、46～59岁、≥60岁设置哑变量，其他连续型变量按照截断值转换成分类变量，剔除由CysC估算的eGFR(共线性)。结果显示，年龄、uβ2-MG、uIgG、uTrF、uα1-MG和CysC是DN的独立危险因素(P<0.05)。见表4。60岁以上的T2DM患者进展为DN的风险是45岁以下人群的2.838倍。
表4 DN的多因素Logistic逐步回归分析
2.6构建Nomogram模型和验证 将上述DN的独立危险因素纳入诊断模型，用R软件建立评估DN风险的列线图模型，见图2A，其中一致性指数C-index为0.919。采用Bootstrap内部验证法进一步分析模型校准度，见图2B，校准曲线显示了预测概率与实际观察概率，Brier分数为0.104。
注：A,评估DKD发生概率的列线图模型；
B,校准曲线。图2 评估DN发生概率的Nomogram列线图模型和校准曲线
运用实例：患者，男性，56岁，因“口干、多饮、多尿”1月余入院，实验室检测结果：年龄56岁、uα1-MG 24.2 mg/L、uβ2-MG < 0.177 mg/L、uIgG 24.6 mg/L、uTrF 8.25 mg/L和血清CysC 0.77 mg/L，其投射至列线图上的分数分别为16、22、0、18、87.5和0分，总分为143.5分，对应DN患病概率为87.0%。
据报道，有20%～40%的DM患者合并DN，发展为终末期肾病(end-stagerenal disease，ESRD)的发生率约为10/1 000人年，我国T2DM患者的DN患病率为21.8%[3,5]。DN患者临床上以持续清蛋白尿和(或)eGFR进行性下降为主要特征，但是部分糖尿病患者未出现尿液清蛋白排泄异常，却已经存在eGFR下降。尿umAlb虽然被广泛应用于临床，umACR也是诊断DN的重要指标，但其测定受多种因素影响，如感染、发热、酮症、高血糖、高血压、心力衰竭、利尿剂使用、月经以及剧烈运动等。Klessens等[6]借助肾活检技术发现106例病理符合DN的患者中有20例始终没有出现蛋白尿，由此可见尿umAlb预测DN具有局限性。传统肾功能诊断指标只有肾功能失代偿期才有明显变化，探寻有价值的诊断指标对于DN早期诊断并实施早期干预对于减少ESRD的发生具有重要意义。
多因素Logistic回归分析结果表明，血清CysC、uα1-MG和uβ2-MG是DN发生的独立危险因素，并且以上3种指标在T2DM组、早期DN组和临床DN组逐渐升高(P均<0.05)，说明其在DN早期就开始异常，且随着病程进展而不断升高。CysC是一种反映eGFR变化的理想的内源性标志物，基于CKD-EPIsCr/CysC计算的eGFR，敏感性、特异性和准确性明显优于sCr，使更多早期CKD患者和umAlb正常的CKD患者得以确诊[7]。Yassine等[8]研究认为DN患者CysC含量较T2DM组和正常对照组升高，并强调其在CKD进展中的作用，与本研究结果一致。血液中的β2-MG和游离的α1-MG均可自由通过肾小球滤过膜，绝大部分在肾近曲小管重吸收和代谢，只有微量从终尿排出[9]。DN早期肾损害可仅表现为肾小球肥大和血流动力学紊乱，但大多数T2DM伴有代谢综合征，表现为肾小管间质、肾内血管病变与肾小球病变的异质性，导致GFR降低，肾小管重吸收功能障碍，血、尿β2-MG水平均升高。Satirapoj等[10]认为肾小管损害标志物与DN预后密切相关，可测定肾小管损害标志物，如CysC、β2-MG、α1-MG、视黄醇结合蛋白、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、肾损伤分子1等。此外，Jiang等[11]研究认为，α1-MG和β2-MG与eGFR显著相关，可能在DN的发展中起重要作用。本文发现eGFR与uα1-MG呈负相关(r=-0.42)，而与uβ2-MG呈弱相关。
蛋白质通过肾小球滤过膜需经过选择性体积屏障和排斥性电荷屏障。在DN发生早期，肾小球毛细血管内皮细胞与基底膜分离，上皮细胞足突融合，进而肾小球滤过膜孔径增大，滤过膜体积屏障受损；
同时肾小球滤过膜因糖基化作用使带负电荷的唾液酸和硫酸肝素减少，导致电荷屏障受损。因此中分子的TrF(相对分子质量77 000，PI=5.7)经肾小球滤过膜滤过，出现在尿液中。TrF带负电荷少于Alb(相对分子质量66 000，PI=4.7)，在糖尿病肾损害早期uTrF比umAlb更易大量出现于尿中。uTrF在单项诊断指标中AUCROC最高，达到0.868，Nomogram列线图中uTrF是诊断DN的主要危险因素。Mohan等[12]在研究中指出，尿IgG增高提示严重的肾损伤，本研究发现早期DN组有57.8%患者uIgG升高，62.6%的患者uTrF升高，说明患者出现轻度蛋白尿时，uIgG和uTrF已经出现，对判断肾小球损伤具有较高的敏感性。宗书等[13]研究认为，uIgG在轻度肾损伤时即出现升高，与本研究结果一致。uTrF和uIgG与umACR呈强正相关，与eGFR呈负相关，因此无论是按照umACR分期，还是依据eGFR判断疾病病程，uTrF和uIgG水平在DN进展中都起到一定作用。
目前国内外关于预测DN发生风险的列线图模型的报道并不多，侯新月等[14]基于糖尿病病程、中性粒细胞计数、贫血、甲状腺激素等指标建立的DN预测模型指出对甄别DN高风险人群，制订干预对策具有指导意义。国外报道将高血压、药物使用、病程、收缩压、舒张压、体质指数、红细胞分布宽度等纳入DN发病风险的独立预测因素[15-16]。本研究纳入诊断模型的指标与上述报道不同，研究方法类似。本研究存在一定的局限性，没有按照肾穿刺活检确诊，而是依靠病程和病历记录来进行回顾性分析研究，依靠umACR水平分组，没有纳入正常清蛋白尿DN，可能存在一定偏倚。但是鉴于肾活检不适用于DN的筛查，T2DM患者因常合并高血压、肥胖、脂代谢紊乱，肾损害病理特征不典型。本研究基于873例T2DM患者，分析了肾小球与肾小管的评价指标，并从中选取有价值的指标建立DN诊断模型，将Logistic回归结果可视化，更直观地应用于个体疾病风险的预测，有助于临床及时发现早期DN患者或高风险人群，及时干预治疗，减少ESRD的发生。
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