尚方园 潘 丽 谷克仁 李雪琴
(河南工业大学，河南 郑州 450001)
据国际橄榄油理事会统计，2020—2021年度全球橄榄油产量及消费量分别为292万，320万t[1]。在橄榄油生产过程中会产生大量的副产品，如：橄榄叶、橄榄渣、橄榄加工废水等，其中橄榄叶可占橄榄油行业加工总量的5%[2-3]。为对抗病原体和昆虫的攻击橄榄树会合成大量的多酚，这些多酚主要储存在其厚实的叶子中[4]。橄榄叶的酚类成分包括裂环烯醚萜类(主要是橄榄苦苷)、类黄酮类化合物(木犀草素、芹菜素、芦丁)和其他酚类物质(羟基酪醇、木质素、生育酚等)[5]。
提取橄榄叶中多酚物质的方法有索氏抽提法[6]、水浴回流法[6]、微波[7]和超声波辅助萃取[8-9]等方法。课题组在试验前期初步对比了索氏抽提、水浴回流、超声波辅助法3种方法，其中采用水浴回流法所得橄榄叶多酚得率最高。而且水浴回流法具有溶剂可循环使用的优点，符合绿色环保，循环利用的理念，因此试验采用水浴回流法提取橄榄叶中的多酚物质。
研究拟采用响应面法优化橄榄叶多酚的水浴回流提取工艺条件，并使用Schaal烘箱法对比添加橄榄叶多酚物质与化学合成抗氧化剂对山茶籽油氧化稳定性的影响，以期为橄榄叶多酚物质在食品工业中的应用提供参考。
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
橄榄叶：阿尔波莎拉，甘肃陇南市祥宇油橄榄开发有限责任公司；
山茶籽油：河南省鲲华生物技术有限公司；
没食子酸、福林酚：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
特丁基对苯二酚(TBHQ)、丁基羟基茴香醚(BHA)：纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司；
碘化钾：分析纯，天津市福晨化学试剂厂；
硫代硫酸钠：分析纯，洛阳市化学试剂厂；
乙醇、三氯甲烷、乙醚、异丙醇、冰乙酸、无水碳酸钠、酚酞、可溶性淀粉：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司。
1.1.2 仪器与设备
紫外可见分光光度计：TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司；
电子分析天平：BSA2245型，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；
真空干燥箱：DZF-6050型，上海精宏实验设备有限公司；
水浴恒温震荡器：DF-101Z型，山东菏泽正虹科技仪器有限公司；
离心机：TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂；
旋转蒸发仪：RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂。
1.2 试验方法
1.2.1 提取方法 准确称取橄榄叶粉末2.0 g于250 mL圆底烧瓶中，在一定的乙醇体积分数、料液比、浸提时间、水浴温度下进行水浴回流提取橄榄叶多酚。
1.2.2 单因素试验 以橄榄叶多酚得率为指标，固定料液比(m橄榄叶∶V乙醇溶液)为1∶25 (g/mL)、水浴温度为70 ℃、浸提时间为2.4 h,考察乙醇体积分数(30%，40%，50%，60%，70%，80%)对橄榄叶多酚得率的影响；
固定乙醇体积分数为50%、水浴温度为70 ℃、浸提时间为2.4 h,考察料液比[m橄榄叶∶V乙醇溶液分别为1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50 (g/mL)]对橄榄叶多酚得率的影响；
固定乙醇体积分数为50%、水浴温度为70 ℃、料液比为1∶40 (g/mL),考察浸提时间(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h)对橄榄叶多酚得率的影响；
固定乙醇体积分数为50%、浸提时间为1.5 h、料液比为1∶40 (g/mL),考察水浴温度(40，50，60，70，80，90 ℃)对橄榄叶多酚得率的影响。
1.2.3 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，选取水浴温度、浸提时间、料液比作为所需优化参数条件，以多酚得率为响应值，通过Box-Behnken试验优化水浴回流提取工艺条件。
1.2.4 橄榄叶多酚对山茶籽油氧化稳定性的影响
(1) 橄榄叶多酚添加量对山茶籽油氧化稳定性的影响：按照质量分数0.02%，0.04%，0.06%，0.08%将橄榄叶多酚分别溶解在装有200 g山茶籽油的锥形瓶中，超声5 min 充分溶解。放入烘箱(60±2) ℃中，每隔4 d取样测定过氧化值与酸价，观察山茶籽油在24 d内的氧化变质情况，每次测定重复3次。
(2) 橄榄叶多酚与合成抗氧化剂的抗氧化活性比较：将质量分数为0.02%的橄榄叶多酚、TBHQ及BHA，质量分数为0.01%的橄榄叶多酚与0.01% BHA、0.01% TBHQ 2种复配剂，分别溶解在装有200 g山茶籽油的锥形瓶中，超声5 min充分溶解。放入烘箱(60±2) ℃中，每隔4 d取样测定过氧化值与酸价，观察山茶籽油在24 d内的氧化变质情况，每次测定重复3次。
1.2.5 测定项目及方法
(1) 多酚含量测定：采用福林酚法[10]。以没食子酸为基准物质绘制标准曲线，分别按式(1)计算多酚得率。
(1)
式中：
R1——多酚得率，%；
C0——橄榄叶提取液中多酚质量浓度，μg/mL；
V——粗提液的体积，mL；
N——稀释倍数；
M0——橄榄叶粉末质量，g。
(2) 过氧化值：参照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》。
(3) 酸价：参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》。
2.1 没食子酸标准曲线的绘制
没食子酸浓度标准曲线图如图1所示。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度值为横坐标，所得没食子酸标准曲线的标准方程为：
A=0.004 3C+0.005(R2=0.999 9)，
(2)
式中：
A——吸光度；
C——没食子酸质量浓度，μg/mL。
2.2 单因素试验
2.2.1 乙醇体积分数对多酚得率的影响 由图2可知，当乙醇体积分数低于50%时，多酚得率随乙醇体积分数的增加而增加；
当乙醇体积分数为50%时，多酚得率增加到最大，为4.63%；
当乙醇体积分数高于50%时，多酚得率随之增加而减小，当乙醇体积分数增至80%时，多酚得率最低。可能的原因是：当乙醇体积分数较低时，水易于渗透植物细胞内部，使部分亲水性大分子物质与乙醇溶液接触，进而影响多酚物质的得率[11]；
当乙醇体积分数较高时会造成蛋白质的变性，可能对乙醇溶液断裂多酚物质与大分子之间结合的氢键有一定的影响，阻碍多酚化合物的溶解，从而降低多酚的得率[12-13]。因此，最优的乙醇体积分数为50%。
图1 没食子酸标准曲线
图2 乙醇体积分数对多酚得率的影响
2.2.2 料液比对多酚得率的影响 由图3可知，当m橄榄叶∶V乙醇溶液从1∶25 (g/mL)增加到1∶50 (g/mL)时，多酚得率呈先上升后下降的趋势，并且m橄榄叶∶V乙醇溶液为1∶40 (g/mL)时得率值最大，为4.90%，可能的原因是：当m橄榄叶∶V乙醇溶液低于1∶40 (g/mL)时，能增大样品与提取溶剂的接触面积，从而使多酚物质充分地从物料中溶出；
当m橄榄叶∶V乙醇溶液高于1∶40 (g/mL)时，多酚得率不增反降，是由于增大料液比的同时，也增大了其他杂质从物料中溶出的机率，从而抑制了多酚的溶出，最终导致多酚得率降低[14]。从降低成本、多酚得率等方面综合考虑得出：选取m橄榄叶∶V乙醇溶液=1∶40 (g/mL) 为优化中心点。
2.2.3 浸提时间对多酚得率的影响 由图4可得，随着浸提时间的增加，多酚得率先增加后减小，当浸提时间为1.5 h时，得率最大，为5.55%，可能是由于随着浸提时间的增加，多酚能从物料中较快地溶出；
达到1.5 h后，继续增大浸提时间，伴随着其他杂质的不断溶出，导致多酚物质得率降低[15]。因此，选取浸提时间1.5 h为优化中心点。
图3 料液比对多酚得率的影响
2.2.4 水浴温度对多酚得率的影响 由图5可知，随着水浴温度的升高，多酚得率呈逐渐上升的趋势,可能的原因是分子运动速率会随着水浴温度的升高而加快，物料的传质扩散速度也就会加快，从而使多酚物质更充分的溶出[16]，但是考虑到乙醇的沸点原因，最终选取水浴温度60，70，80 ℃进行响应面试验。
图4 浸提时间对多酚得率的影响
图5 水浴温度对多酚得率的影响
2.3 响应面试验
2.3.1 响应面优化试验方案及结果 在单因素试验基础上，以橄榄叶多酚得率为响应值(Y)，选取水浴温度、浸提时间、料液比作为所需优化参数条件，进行响应面优化试验，因素及水平见表1，试验方案及结果见表2。
表1 响应面优化试验因素水平表
表2 响应面试验方案及结果
2.3.2 回归方程拟合效果分析及响应因子显著性分析
对表3中的响应因子进行多元回归拟合，得到二次回归方程：
R=5.740 0+0.188 8A-0.132 5B-0.078 8C-0.045 0AB-0.102 5AC+0.110 0BC-0.483 8A2-0.116 3B2-0.473 7C2。
(3)
表3 方差分析†
2.3.3 交互作用 由图6(a)和图6(b)可知，当料液比不变时，多酚得率随水浴温度及浸提时间的增加先升高后降低，响应曲面图坡度平坦，等高线图偏圆形，说明水浴温度与浸提时间之间的交互作用较小；
由图6(c)和图6(d)可知，当浸提时间不变时，多酚得率随水浴温度及料液比的增加先升高后降低，响应曲面图坡度较陡，等高线呈椭圆形，说明水浴温度与料液比之间的交互作用显著；
由图6(e)和图6(f)可知，当水浴温度不变时，多酚得率随浸提时间及料液比的增加先升高后降低，响应曲面图坡度偏陡，等高线呈椭圆形，说明浸提时间与料液比之间的交互作用显著。
图6 因素交互作用对多酚得率影响的响应面和等高线图
2.3.4 最优方法验证 通过响应面试验获得橄榄叶多酚提取的最佳工艺条件为水浴温度72.48 ℃、浸提时间1.145 h、液料比1∶40 (g/mL)，多酚得率为5.82%。为了便于工艺条件在实际应用中操作，将水浴温度、浸提时间分别调整为72 ℃、1.0 h，在此基础上，通过3次平行重复验证实验，得出多酚得率高达5.86%，预测偏差为0.77%，表明该模型能较好地预测多酚得率。
2.4 橄榄叶多酚对山茶籽油氧化稳定性的影响
2.4.1 橄榄叶多酚添加量对山茶籽油氧化稳定性的影响
前期试验发现，当橄榄叶多酚质量分数低于0.02%时，橄榄叶多酚物质对山茶籽油的抗氧化效果不明显，因此试验中添加橄榄叶多酚物质从0.02%开始添加。由图7可知，与空白山茶籽油相比，随着时间的增加，添加0.02%，0.04%橄榄叶多酚均能明显降低山茶籽油的过氧化值与酸值，说明添加0.02%，0.04%橄榄叶多酚均能明显降低山茶籽油的氧化酸败速度，相反添加0.06%，0.08% 橄榄叶多酚加速了山茶籽油的氧化酸败速度，可能是过量的橄榄叶多酚具有助氧化的作用[18-19]。放置相同时间时，山茶籽油的过氧化值与酸值的大小顺序为：0.08%橄榄叶多酚油样>0.06%橄榄叶多酚油样>空白油样>0.04%橄榄叶多酚油样>0.02%橄榄叶多酚油样，说明添加0.02%橄榄叶多酚具有较好的抗氧化效果。
图7 橄榄叶多酚对山茶籽油氧化稳定性的影响
2.4.2 橄榄叶多酚与TBHQ及BHA的协同作用对山茶籽油氧化稳定性的影响 由图8可知，与空白山茶籽油相比，添加质量分数为0.02%的橄榄叶多酚、TBHQ、BHA均能明显降低山茶籽油的过氧化值与酸值，其中添加0.02%橄榄叶多酚的过氧化值与酸值低于同等浓度的BHA，高于TBHQ，说明橄榄叶多酚的抗氧化效果优于BHA，次于TBHQ；
与添加质量分数均为0.02%的橄榄叶多酚、TBHQ、BHA相比，随着时间的增加，添加0.01%橄榄叶多酚+0.01% TBHQ的山茶籽油的过氧化值与酸值低于添加0.02%橄榄叶多酚的油样，高于添加0.02% TBHQ的油样；
添加0.01%橄榄叶多酚+0.01% BHA的山茶籽油的过氧化值与酸值高于添加0.02%橄榄叶多酚的油样，低于添加0.02% BHA的油样，说明添加0.01%橄榄叶多酚与0.01% TBHQ、0.01%橄榄叶多酚与0.01% BHA均具有协同增效的作用，并且具有增强山茶籽油抗氧化效果的能力。
图8 橄榄叶多酚与TBHQ及BHA的协同作用对山茶籽油的氧化稳定性的影响
采用乙醇溶液水浴回流提取橄榄叶中的多酚，运用响应面法优化橄榄叶多酚的提取工艺条件为：乙醇体积分数50%、浸提时间1.0 h、料液比1∶40 (g/mL)、水浴温度72 ℃，此条件下橄榄叶多酚得率为5.86%。橄榄叶多酚对山茶籽油的氧化稳定性影响研究表明：当多酚质量分数为0.02%时，橄榄叶多酚对山茶籽油具有较好的抗氧化效果；
橄榄叶多酚对山茶籽油的抗氧化效果优于丁基羟基茴香醚，次于特丁基对苯二酚；
橄榄叶多酚与特丁基对苯二酚及丁基羟基茴香醚具有协同增效作用。但是橄榄叶多酚中主要起抗氧化作用的活性成分及影响山茶籽油氧化稳定性的机制仍需要进一步研究。