刘秋龙 邢金良 高一钊 王珍妮 周凯翔 张召辉 周峰 郭旭
作者单位：712000 咸阳 1陕西中医药大学医学技术学院；
710032 西安 2空军军医大学基础医学院生理与病理生理教研室；
221000 徐州 3中国人民解放军陆军第七十一集团军医院
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其高危人群主要为病毒性肝炎、慢性肝病和肝硬化患者，严重威胁人类生命健康［1］。目前，HCC的防治形势仍然严峻，因此亟需寻找高效、灵敏的标志物用于其早期筛查及临床诊断。近年有研究显示，线粒体DNA基因组不稳定性（mitochondrial genome instability，mtGI）在HCC的发生和发展过程中发挥重要作用［2］。mtGI是肿瘤细胞的主要特征，主要表现为各种类型的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）变异。mtDNA变异可分为“质变”和“量变”两大类，其中“质变”包括单碱基替换（点突变）、片段插入缺失等突变，“量变”主要指拷贝数变异。既往研究多在组织水平层面探索mtDNA变异［3］。然而，近年来越来越多的研究发现，肿瘤组织或转移灶中的mtDNA可释放到外周血循环中，因此检测肿瘤来源的mtDNA变异在肿瘤早期诊断、治疗及预后评估等方面具有巨大的应用前景。本课题组前期研究也发现HCC患者血浆及外泌体中存在多种类型mtDNA变异［4-5］。本文就HCC中的mtDNA变异及其在液体活检中的应用进展进行综述，以期为HCC防治提供新的借鉴。
1.1 单碱基替换
肿瘤细胞中存在多种mtDNA突变类型，其中单碱基替换又称点突变，是mtDNA最常见的突变类型，从来源上可分为体细胞突变和遗传突变。细胞中的mtDNA具有多拷贝特性，因此mtDNA体细胞突变常呈现“异质性”，即细胞中野生型和突变型mtDNA共存。而mtDNA遗传突变往往是“同质性”的，即细胞中突变型mtDNA占比为100%。目前已有多项研究分析了HCC患者mtDNA点突变的特征，如本课题组对156例乙型肝炎病毒（HBV）相关HCC（HBV-HCC）患者的mtDNA进行深度测序分析，结果发现HCC组织中mtDNA点突变类型主要为C-T替换与T-C替换两种形式，其中C-T替换所占比例在HCC组织中高于癌旁组织，而T-C替换趋势则相反［6］。线粒体基因组由16 569 bp组成，分为编码区与非编码区，其中非编码区是点突变发生频率最高的区域，主要由D-loop区组成［6］。D-loop区由1 122 bp序列组成，包含mtDNA转录与复制的起始位点，因此D-loop区在mtDNA突变研究中备受关注。本课题组还分析了156例HCC组织样本mtDNA，发现癌组织和癌旁炎症组织中均存在大量mtDNA异质性体细胞突变，且在癌组织和癌旁炎症组织中D-loop区的突变密度（突变数量/突变区域长度）远高于mtDNA的其他区域［6］。但在整个线粒体基因组层面，癌组织mtDNA突变密度明显少于炎症组织。然而，在癌组织中会积累更多的高致病性突变，且其突变平均异质性水平明显高于与炎症组织，提示这些异质性突变在推动HCC发生发展中可能发挥重要作用。
mtDNA点突变与HCC恶性进展以及患者预后也密切相关，有望成为HCC新型预后评估标志物。LIN等［7］通过一代测序鉴定了25例HCC患者癌组织mtDNA D-loop区多个突变位点，发现12S rRNA（MT-RNR1）基因709位碱基基因型与患者不良预后相关，当709位为A碱基时，其基因编码的小功能肽MOTS-c表达量明显较709位为G碱基时低，而MOTS-c低表达有利于肿瘤细胞转移，从而导致患者不良预后。WANG等［8］对59例HCC患者的92个mtDNA单核苷酸多态性（SNPs）进行分析，发现位于D-loop区146位的T-C遗传突变可能是HCC患者独立的生存预测因子，146位等位基因为C碱基的HCC患者术后累积存活率显著低于146位为T碱基的患者（P=0.047）。本课题组也发现根据D-loop区是否包含mtDNA体细胞突变可有效预测HCC患者预后［6］。
1.2 片段插入缺失
除点突变外，mtDNA片段插入缺失也是肿瘤细胞常见的突变方式。目前已在肿瘤细胞中发现超过100个mtDNA区域存在片段插入缺失，其中关于HCC片段插入的研究也不断深入。LI等［9］通过对140例接受手术治疗的HCC患者肿瘤组织mtDNA测序分析发现，315N和315C的患者中位无肿瘤生存时间分别为12个月和15个月（P=0.016）。HCC组织细胞中常发生的短片段缺失主要为348～356位和298～306位重复序列之间的50 bp片段缺失，而这种缺失在多种类型癌组织中也同样存在［3］。除此之外，mtDNA的4 977 bp长片段缺失也是癌症常见的突变［10］，其缺失主要发生在8 470～8 482位和13 447～13 459位两个重复序列之间，包含了7个氧化磷酸化亚基编码基因（ATP6、ATP8、COXIII、ND3、ND4L、ND4、ND5）和 5 个 mtRNA编码基因，因此该片段的缺失会严重影响线粒体的正常功能。在HCC中，近年已有研究报道，与正常人相比HCC患者的4 977 bp缺失发生频率明显增高（P＜0.05）［11］。但是，YIN等［12］在检测18例HCC患者癌组织及其癌旁组织D-loop区序列时，发现癌旁组织中4 977 bp缺失的比例远高于HCC组织，且认为这可能是由于肿瘤细胞大量扩增时，带有mtDNA缺失的细胞可能存在代谢异常引起。还有研究报道，当细胞中发生4 977 bp缺失的mtDNA比例超过一定范围，线粒体的跨膜电位、ATP合成、线粒体呼吸链中多种酶的合成及氧化磷酸化过程将受严重影响，甚至造成呼吸链中断，因此恶性肿瘤细胞在大幅度增殖过程中可能通过凋亡将这些异常细胞淘汰，从而致使发生缺失的细胞所占比例减少［13］。mtDNA片段插入缺失尤其是4 977 bp长片段缺失是HCC发生发展机制研究中的重要内容。
2.1 肿瘤组织mtDNA拷贝数
线粒体基因组与核基因组不同，每个细胞中包含多个mtDNA拷贝［12］。mtDNA作为电子传递链的必要模板，其拷贝数在一定程度上决定了线粒体的氧化还原能力，因此mtDNA拷贝数与线粒体功能密切相关。据统计，肝脏组织细胞中平均含有500～2 000个mtDNA拷贝［14］。正常情况下，mtDNA拷贝数往往保持在恒定范围内，以维持细胞能量水平和基本功能，而在HCC患者癌细胞中常发现mtDNA拷贝数变异。目前研究普遍认为mtDNA拷贝数变异与线粒体内膜活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多引起mtDNA氧化损伤有关。当轻度氧化损伤时，为了代偿减弱的氧化磷酸化及其他线粒体功能，mtDNA复制转录系统活性增强，从而引起拷贝数增加。而当氧化损伤超过mtDNA损伤修复系统代偿能力时，mtDNA严重损伤而发生广泛突变，为了清除功能障碍的线粒体，最终触发线粒体自噬机制，从而导致拷贝数减少［15］。有研究［16］发现HCC患者癌组织mtDNA拷贝数降低与患者预后密切相关。该研究通过分析71例HCC患者癌组织和癌旁组织mtDNA，结果发现67%的HCC患者癌组织mtDNA拷贝数显著低于癌旁组织；
进一步根据癌组织与癌旁组织mtDNA拷贝数比值（≥1或＜1）分组，发现与高mtDNA拷贝数HCC患者相比，低mtDNA拷贝数患者更易出现肿瘤包膜不完整和微血管侵犯，5年生存率也更低。考虑到D-loop区域在mtDNA复制调控中的关键作用，本课题组［6］通过检测156例HCC患者癌组织mtDNA，证实其mtDNA拷贝数减少与患者不良预后相关，同时在HCC细胞系中探索D-loop突变与mtDNA拷贝数的关系，结果发现，与D-loop未突变的HCC细胞系相比，D-loop突变的HCC细胞系具有更强的增殖、迁移和侵袭能力；
进一步通过过表达或敲除线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）成功建立mtDNA拷贝数增高和降低的HCC细胞模型，发现mtDNA拷贝数增高的HCC细胞增殖、迁移、侵袭能力减弱，而mtDNA拷贝数降低的HCC细胞增殖、迁移、侵袭能力则增强。提示肿瘤组织D-loop区突变可能通过减少mtDNA拷贝数影响HCC细胞的增殖、侵袭和转移，进而影响HCC患者的预后［6］。此外，HCC患者癌组织mtDNA的D-loop区突变和mtDNA拷贝数变异往往同时发生，由此判断D-loop区突变可能是引起mtDNA拷贝数降低的原因之一［3］。由于D-loop区作为mtDNA复制起始区域，而TFAM是维持mtDNA拷贝数的关键物质，因此D-loop区突变会影响TFAM对mtDNA的结合以及随后的复制，从而导致mtDNA数量降低。
2.2 外周血mtDNA拷贝数
如前所述，肿瘤组织mtDNA拷贝数变异与HCC患者预后密切相关，目前越来越多的研究也证实外周血白细胞mtDNA拷贝数具有作为HCC预后风险评估生物标志物的潜力。HOSSAIN等［17］发现，与慢性肝病患者和健康受试者相比，HCC患者外周血白细胞mtDNA拷贝数显著降低，而慢性肝病患者与健康受试者的白细胞mtDNA拷贝数差异并不显著。此外，本课题组研究［18］检测618例HCC患者术前外周血白细胞mtDNA拷贝数，发现白细胞mtDNA拷贝数较高的患者更易复发；
同时评估白细胞mtDNA拷贝数与总生存率和无复发生存期的关系，根据mtDNA拷贝数构建了ROC曲线，结果显示mtDNA拷贝数值为0.98，是OS和RFS的最佳截断值；
与白细胞mtDNA拷贝数低的HCC患者相比，白细胞mtDNA拷贝数高的患者死亡风险和复发风险分别增加约1.89倍和约1.86倍。此外，通过过表达TAFM因子诱导T淋巴母细胞系Jurkat和H9细胞mtDNA增高，发现更高的mtDNA拷贝数可通过增加ROS介导TGF-β1分泌，从而诱导Treg和NK细胞数量降低，最后导致HCC的预后不良。同时，联合白细胞mtDNA含量和TNM分期预测HCC患者预后，发现TNM Ⅲ/Ⅳ期且具有高mtDNA含量的患者OS和RFS较差，而TNM Ⅰ/Ⅱ期且mtDNA含量低的患者OS和RFS较好。因此，白细胞mtDNA拷贝数能作为TNM分期补充而用于评估HCC进展。
液体活检是近年来新出现的一种检测技术，主要围绕体液中的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环游离核酸（cfDNA和cfRNA）、细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）、蛋白质以及肿瘤代谢产物进行检测［19］。与组织活检相比，液体活检在无创、实时监测、克服肿瘤异质性等方面具有巨大优势。其中cfDNA可以分为两大类，即游离核DNA（cfnDNA）和游离线粒体DNA（cfmtDNA）［20］。既往研究发现cfmtDNA在血浆中的稳定性高于cfnDNA，因此更有利于作为生物标志物进行癌症诊断与监测［21］。也有研究报道，与乙型肝炎、丙型肝炎在内的肝炎患者及健康人相比较，HCC对应肝炎患者血浆中的cfmtDNA拷贝数均显著降低。本课题组通过对HCC患者、肝炎患者以及健康人血浆cfmtDNA检测，观察到HCC患者血浆cfmtDNA的拷贝数明显低于健康人和肝炎患者（P＜0.001）［5］；
同时本课题组分别检测了116例HBV-HCC患者及232例HBV肝炎患者血浆cfmtDNA，发现HBV-HCC组血浆cfmtDNA含量显著低于HBV肝炎组（P=1.7×10-5）［22］；
HASHAD等［23］检测了丙型肝炎病毒相关HCC（HCV-HCC）患者、HCV相关肝硬化患者及健康人血浆cfmtDNA各45例，发现与HCV肝炎组和健康对照组相比，HCV-HCC组的血浆cfmtDNA含量最低（P＜0.001），HCV肝炎组和健康对照组之间无显著差异（P=0.177）。以上研究结果显示HCC中的mtDNA常以低拷贝数形式存在，提示血浆cfmtDNA拷贝数有望成为诊断HCC的一种潜在的新型非侵入性生物标志物。
除血浆cfmtDNA拷贝数外，血浆cfmtDNA体细胞突变也是HCC液体活检的重要研究方向，但如何准确识别血浆中肿瘤来源的DNA突变仍是血浆游离DNA突变应用于肿瘤液体活检的难点。本课题组［5］通过优化的二代测序技术对5例HCC患者和10例结直肠癌患者的肿瘤组织、癌旁正常组织、外周血白细胞及血浆cfmtDNA进行深度测序，结果仅发现血浆cfmtDNA中存在与癌组织来源的肿瘤特异性突变，同时也发现了血浆cfmtDNA的特有突变，但仍无法判断其具体来源，有待进一步深入研究。因此，血浆cfmtDNA可能是诊断HCC潜在的新型非侵入性生物标志物。
片段组学是近期液体活检领域新的发展方向，主要围绕体液中游离DNA特征进行系统性检测，包括游离DNA片段长度、分布及DNA片段末端的核苷酸基序等。mtDNA片段组学的研究主要包括cfmtDNA和EV mtDNA。AN等［24］分析了16例HCC患者以及32例健康人的血浆cfmtDNA，发现HCC患者平均cfmtDNA长度分布在109 bp左右，较健康人（142 bp）短；
在HCC患者中，血浆cfmtDNA片段大小与患者的肿瘤负荷以及cfDNA浓度呈负相关。既往研究也发现EVs中包含游离mtDNA，通过测序发现其序列可覆盖整个线粒体基因组［4］。EVs是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径在40～1 000 nm之间。本课题组［4］利用HCC患者、肝炎患者和健康人全基因组数据进行片段大小分析，发现以下特征：cfmtDNA的片段长度集中在80 bp，而EV mtDNA的片段长度集中在130 bp左右；
肝炎患者EV mtDNA＞300 bp的比例显著高于HCC患者和健康人，而HCC患者与健康人之间没有显著差异；
与健康对照组相比，HCC和肝炎患者的EV mtDNA拷贝数显著降低，但HCC和肝炎患者EV mtDNA拷贝数无明显差异，这些研究结果显示了EV mtDNA拷贝数作为HCC诊断生物标志物的潜在价值。但是，目前关于HCC患者体液中的mtDNA标志物研究仍有限，有待进一步挖掘更具特异性的标志物。
近年来，液体活检技术在新型肿瘤标志物临床应用中取得突破性进展，其中围绕体液中的核基因组ctDNA检测发展最为迅猛，但因其在外周血中丰度低，检测技术要求高，目前仍未有理想的临床转化产品。液体活检正指向mtDNA的拷贝数、突变及片段组学等方面的研究，不断为mtDNA作为HCC液体活检肿瘤标志物提供有力证据，使得具有高突变率、多拷贝数和检测成本低等优势的mtDNA有望成为HCC更理想的液体活检新型标志物。因此，围绕外周血mtDNA拷贝数变异、突变和片段组进行精准检测，可能是寻找更有效的HCC诊断、监测及预后评估新方法及新策略的重要方向。相信随着更为精准的针对mtDNA的二代测序技术发展和机器学习技术的应用，mtDNA变异在HCC中的研究将不断深入，mtGI相关标志物用于HCC的临床诊断、治疗评估、预后预测将成为可能。
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