张 念， 彭怡霖， 陈细羽， 焦必宁,2,3， 张耀海*,2,3
(1.西南大学/中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712;2.农业农村部柑桔及苗木质量监督检测测试中心，重庆 400712;3.农业农村部柑桔产品质量安全风险评估实验室，重庆 400712)
作为一类重要的水溶性色素，花青素广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中，属于类黄酮化合物，具有抗癌、抗氧化等多种生物功效。目前已知的天然花青素有20多种，常见的有6种，如飞燕草素、矢车菊素、矮牵牛素、天竺葵素、芍药素和锦葵素等(图1)[1]。花青素在自然界中主要以糖苷化和酰基化(即花色苷)方式存在，花色苷种类众多，很难建立全部花色苷的检测方法。但是将花色苷酸化水解后形成花青素单体后，进行检测则变得简单可行[2]。植物源性食品中花青素的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3 - 11]、超高效液相色谱法(UPLC)[12,13]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[8 - 11,14]。HPLC法是最常用的方法，具有价廉、易操作和稳定性好等优点。然而HPLC法存在溶剂用量大、分离度差、耗时长等缺点。UPLC法具有高效、分离度高、峰形尖锐、成本低、环境友好、结果精确等特点，已逐渐成为食品分析检测的有效工具[12,13]。LC-MS联用技术结合了色谱和质谱两者的优点，将色谱的高分离性能和质谱的高鉴别特点相结合，已成为准确定性检测花青素的技术之一。但LC-MS/MS仪价格昂贵，难以普及。目前国内外对植物源性食品中花青素的研究主要集中于葡萄和一些特色水果，如草莓、黑莓、蓝莓、车厘子、石榴、覆盆子和黑加仑等，特别是国外已对当地葡萄品种做了比较详细的分析[15 - 22]，但国内还未有UPLC法快速检测多种植物源性食品中花青素的相关报道，而有关我国植物源性食品中花青素也缺乏详细系统的研究报道[18,19]。
图1 6种花青素的分子结构式
本文在前人研究基础上，优化了植物源性食品中花青素的提取条件，并建立快速、有效的UPLC方法，对我国7个葡萄品种和7种植物源性食品中主要花青素物质含量进行测定，分析比较不同植物源性食品中花青素物质的种类和含量差异，探究花青素与植物源性食品的相互关系，旨在充实植物源性食品功能性成分数据库，为合理开发利用植物源性食品资源、提高植物源性食品综合利用价值提供科学依据。
1.1 仪器、试剂及材料
Waters ACQUITY超高效液相色谱仪(2996 PDA检测器，Version 4.1 Empour工作站)，美国Waters公司；
Milli-Q Advantage A10超纯水器，美国Millpore公司；
XS205电子天平，PB3002-S/FACT分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；
0.22 μm水相针式滤器，上海安谱科学仪器有限公司；
GENIUS 3漩涡仪，德国IKA公司；
SB 5200DTS超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；
DF-101S集热式恒温加热器，郑州科泰实验设备有限公司。
飞燕草色素(纯度≥95.0%)、矢车菊色素(纯度≥98.0%)、天竺葵色素(纯度≥97.0%)，美国Sigma-Adrich公司；
矮牵牛色素(纯度≥97.5%)、芍药素(纯度≥97.6%)、锦葵色素(纯度≥97.0%)，美国Chromadex公司；
乙腈和甲醇为色谱纯，德国CNW Technologies GmbH公司；
乙醇、盐酸、甲酸为分析纯，成都市科龙化工试剂厂。
7个葡萄品种包括摩尔多瓦、夏黑、巨峰、红提、美人指、水晶葡萄、阳光玫瑰。其中，摩尔多瓦、水晶葡萄和阳光玫瑰来自贵州，夏黑和美人指来自江苏，巨峰来自浙江，红提来自广西。其他7种植物源性食品包括紫薯、紫甘蓝、蓝莓、黑玉米、洋葱、茄子、血橙，均来自重庆。
1.2 标准溶液的配制
准确称取6种花青素标准物质各5 mg于10 mL容量瓶中，分别用10%盐酸甲醇溶液溶解并定容至刻度，配制成500 mg/L的标准品储备溶液，存放于棕色瓶中，于-80 ℃保存，备用。
1.3 样品前处理
样品的取样参考相关标准[24]，并做一定改进。称取样品5 g于离心管中，加入25 mL提取液(无水乙醇+水+盐酸，体积比为2∶1∶1)，超声提取30 min；
油浴(95 ℃)中水解1 h，取出后冷却，提取液定容至25 mL。摇匀，静置，取上清液，经0.22 μm微孔水相滤膜过滤后，上机检测。
加标实验中葡萄的加标水平为1 mg/kg和10 mg/kg两个水平。分别向5 g样品中加入100 μL的50 mg/L和100 μL的500 mg/L标准溶液，混匀备用。前处理如上。
1.4 实验方法
1.4.1 UPLC条件参考相关标准[25]，并做相应的改进：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm，美国Waters公司)；
流动相A为1%甲酸水溶液,流动相B为1%甲酸乙腈溶液。优化后洗脱梯度：0～0.8 min，92%A；
0.8～2 min，88%A；
2～4 min，82%A；
4～4.8 min，80%A；
4.8～6 min，75%A；
6～7.2 min，70%A；
7.2～8 min，55%A；
8～8.8 min，80%A；
8.8～12 min，92%A。柱温：35 ℃，流速：0.3 mL/min，进样量：3 μL，检测波长：530 nm。
根据标准样品的保留时间判断样品中花青素的组分，并采用不同浓度的混合标准样品与对应的峰面积值间的关系制作标准曲线(r2>0.999)，采用积分获取样品的峰面积，再根据标准曲线计算样品相关组分含量。
1.4.2 数据分析采用Origin 9.0软件绘图、数据统计。所有样品均采用3次平行测定，测定结果以平均值±SD值表示。
2.1 仪器条件的优化
相关标准(NY/T 2640-2014)《植物源性食品中花青素的测定》[25]采用HPLC法，相应的色谱柱是C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，分析时间达30 min。本文将HPLC法换成UPLC法，仪器条件优化后的标准色谱图见图2。6种花青素在5 min内达到较好的分离，尽管芍药素和锦葵色素未达到完全的基线分离，但分离效果也好于相关标准[25]。与传统的HPLC法相比，UPLC法的分离时间只有原来的1/3[2,19]，大大缩短了分析时间。
图2 6种花青素标准的色谱图
2.2 样品前处理的优化
花色苷酸化水解成花青素单体，目前大多采用酸化乙醇体系[2,20]，我们采用无水乙醇+水+盐酸(体积比为2∶1∶1)提取体系[2]。实验重点考察了油浴温度和油浴时间对葡萄(夏黑)中花青素提取效率的影响，结果如图3所示。油浴时间固定在60 min，增加油浴温度(选取80、85、90、95、100、110和120 ℃)，随着油浴温度的升高(80到90 ℃)，花青素提取效率显著升高，90～100 ℃趋于平缓，95 ℃达到最佳，而后逐渐降低；
过高的温度(大于110 ℃)对花青素提取是不利的。油浴温度固定在95 ℃，增加油浴时间(选取30、45、60、75和90 min)，随着油浴时间的延长(30到60 min)，花青素提取效率逐渐升高，60 min达到最佳，而后逐渐降低。因此我们选择油浴温度95 ℃和油浴时间60 min。
图3 反应温度(A)和反应时间(B)对提取效率的影响
2.3 方法评价
在优化的实验条件下，对系列浓度标准溶液进行检测，结果见表1。6种花青素在0.1～25 mg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数达到0.999以上。仪器检出限(S/N=3)为0.02～0.05 mg/L，定量限(S/N=10)为0.05～0.1 mg/L。保留时间和峰面积的日内偏差分别为0.5%～1.6%和0.8%～2.2%；
日间偏差分别为1.3%～2.3%和3.4%～6.8%。
表1 6种花青素的线性范围、线性方程、检出限和定量限
采用对葡萄加标的方法进行回收率和精密度实验。分别对样品进行两个水平的加标回收实验，以“1.3” 的方法对样品进行前处理，平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差(表2)。结果表明：在葡萄样品中，2种添加水平的回收率在82.3%～93.5%之间，相对标准偏差(RSD)在1.4%～6.8%之间。本方法有较好的准确度和精密度，满足葡萄中花青素定量分析的要求。此方法的检出限为0.1～0.2 mg/kg，定量限为0.2～0.5 mg/kg。
表2 6种花青素的平均回收率、相对标准偏差(RSD)、检出限(LOD)和定量限(LOQ)
2.4 实际样品测定
抽取14种植物源性食品，采用上述方法处理后测定，结果列于表3。
表3 14种植物源食品中花青素的含量(mg/kg鲜重)
2.5 植物源性食品中花青素含量
总体上，累计检出6种花青素。在14种植物源性食品中，紫甘蓝中矢车菊色素最丰富，最高可达323.81 mg/kg；
摩尔多瓦中锦葵色素含量较高，可达167.87 mg/kg；
蓝莓中的飞燕草色素含量最高可达121.19 mg/kg；
紫薯中芍药素含量较高，可达61.07 mg/kg；
夏黑中矮牵牛色素含量高达55.96 mg/kg；
蓝莓中天竺葵色素200.42 mg/kg。14种植物源性食品平均含量呈以下规律：矢车菊色素>锦葵色素>飞燕草色素>天竺葵色素>芍药素>矮牵牛色素。
14种植物源性食品中的花青素含量变幅大，总含量变幅从2.20 mg/kg到477.42 mg/kg。蓝莓最高，紫甘蓝、摩尔多瓦、夏黑和茄皮其次。花青素较高的品种，依次为紫薯、黑玉米、血橙、巨峰、红提(20 mg/kg到80 mg/kg)。花青素较少的品种，依次为美人指、洋葱(10 mg/kg到20 mg/kg)。花青素最低的品种如水晶葡萄、阳光玫瑰均低于5 mg/kg。
不同水果和蔬菜中的花青素种类有显著性差异。天竺葵色素仅在紫薯、蓝莓、茄皮中检出，矢车菊色素在13种植物源性食品中均有检出(除茄皮)。摩尔多瓦、夏黑、巨峰检出5种花青素(除天竺葵色素)；
美人指检出飞燕草色素、矢车菊色素、芍药素、锦葵色素等4种花青素；
红提检出飞燕草色素、矢车菊色素、芍药素等3种花青素；
水晶葡萄和血橙检出飞燕草色素、矢车菊色素等2种花青素；
阳关玫瑰和洋葱只检出矢车菊色素1种花青素。紫甘蓝和黑玉米检测出矢车菊色素、矮牵牛色素、芍药素等3种花青素。紫薯矢车菊色素、矮牵牛色素、芍药素、天竺葵色素等4种花青素。茄皮中只检测出飞燕草色素、矮牵牛色素、天竺葵色素等3种花青素。紫薯检测出矢车菊色素、矮牵牛色素、芍药素、锦葵色素、天竺葵色素等5种花青素。蓝莓检测出飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、芍药素、锦葵色素、天竺葵色素等6种花青素。
花青素的检测方法列于表4。本文采用UPLC-PDA方法快速检测植物源性食品中6种花青素，所需时间仅为12 min，仅为现有HPLC方法的4/30至3/7[3 - 11]，其检测限低于绝大数现有方法，回收率良好。
表4 本文方法与其它测定食品中花青素的方法的比较
(续表4)
植物源性食品含有丰富的花青素物质，由于品种、生长环境和基因差异导致花青素物质的含量存在明显差异。蓝莓中花青素含量最丰富，检测出的种类也最多。不同植物源性食品的花青素含量变幅大，不同植物源性食品的花青素种类有显著性差异。本研究利用改进的前处理技术，结合UPLC技术，更快速、高效地检出花青素物质，并分析比较了不同植物源性食品中花青素物质的种类和含量差异，旨在为植物源性食品的健康价值评估提供了数据支持，这对花青素功能成分开发利用具有重要意义。
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