叶禹彤，艾仄宜，李荣林，穆兵，田洋，杨亦扬*
（1.江苏省农业科学院休闲农业研究所，江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏南京 210014）
（2.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201）
黄金芽为光照敏感型、黄色系白化茶新品种，春、夏、秋三季新梢均呈黄色，所制茶品质特点明显，色泽突出“三黄”，即干茶亮黄、汤色嫩黄、叶底明黄[1]，观赏价值高，栽种面积逐年增长。目前生产多采用春季细嫩茶青进行名优绿茶的加工，单产偏低，春季后期及夏、秋季鲜叶资源被大量浪费[2]。同时关于黄金芽加工方式精准研究较少，目前仅有针对受热后叶片进行闷黄工序来保留黄金芽鲜叶嫩黄的外观色泽的研究，因此有必要针对其品种特性，开展不同加工方式对提升黄金芽茶品质的相关研究，促进黄金芽鲜叶的有效利用。
杀青是绿茶加工中品质形成最关键的工序[3]。祁丹丹等[4]研究表明滚筒杀青夏季绿茶苦味较强，但具有高长的栗香。吴雅丽[5]研究发现蒸汽杀青方式穿透力强，叶绿素损失较少，有利于突出滋味和色泽的特点，一定程度上能提高秋季茶品质。朱德文等[6]研究表明微波杀青绿茶外形色泽紧实翠绿，叶底嫩绿明亮，对茶叶内含物具有较高的保留特性，但滋味不如蒸汽杀青。目前，关于不同杀青方式对黄金芽这种特异品种的秋茶品质影响的研究还未见报道。黄金芽秋季仍能保持高氨低酚的特点，在制作绿茶上明显优于其他茶树品种。本研究通过感官审评，结合高效液相色谱、三重四级杆质谱技术对所制得的秋季黄金芽绿茶进行品质评价，并采用体外模拟方法测定其抗氧化活性，探讨不同杀青方式对秋季黄金芽绿茶品质和抗氧化活性的影响，以期为秋季黄金芽绿茶的综合利用提供参考。
1.1 材料与试剂
鲜叶原料：选用江苏现代农业（茶叶）产业技术体系仪征推广示范基地（经度119.06，纬度32.34）黄金芽品种一芽二叶为主要原料，采制时间为2020年9月。
实验试剂：没食子酸（GA）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）及咖啡碱标准品购于上海源叶生物科技有限公司；
乙腈、甲醇、甲酸铵、甲酸（HPLC级）购于美国默克公司；
氨基酸标准样品购于麦克林试剂有限公司；
抗氧化能力（T-AOC）购于南京建成生物科技公司；
1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、甲酸、甲醇、丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸、硫酸、蒽酮、福林酚、碳酸钠、水合茚三酮、氯化亚锡等均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
茶叶加工设备：上洋6CST-50滚筒杀青机、上洋6CH-20茶叶烘干机、上洋6CHT-6.0提香机、美的（Midea）M1-L213B微波炉、北京永光明FW-100高速万能粉碎机。
品质分析仪器：赛多利斯BSA124S-电子天平、上海光棱756s-紫外可见分光光度计、柯尼卡美能达CM-23D分光测色仪、Agilent-1260液相色谱仪、BIOTEK-Cytation5酶标仪、INSENT味觉分析系统-SA402B电子舌、Agilent-1290UPLC系统、ABsciex 4500三重四级杆质谱检测器、艾本德5418R台式高速离心机、Analyst工作站、屈臣氏蒸馏水购买于当地大润发超市。
1.3 试验方法
1.3.1 样品制备
茶鲜叶（一芽二叶）采摘后混匀，在室内进行摊放，摊放厚度为3 cm，摊放时间为3 h，每小时进行一次翻叶。对试验样品分别同时进行滚筒、蒸汽、微波杀青处理。
滚筒杀青处理：滚筒杀青（90 s）→毛火（120 ℃，15 min）→足火（90 ℃，30 min）
蒸汽杀青处理：蒸汽杀青（90 s）→毛火（120 ℃，15 min）→足火（90 ℃，30 min）
微波杀青处理：微波杀青（中高火90 s）→毛火（120 ℃，15 min）→足火（90 ℃，30 min）
以上三种方式获得的干茶用高速万能粉碎机粉碎，用于后续化学成分分析。
1.3.2 感官品质分析
参照国家标准GB/T 23776-2018对不同杀青处理的绿茶进行感官审评[7]。单项审评满分为100，加权评分按照外形25%、汤色10%、香气25%、滋味30%、叶底10%计算品质总分。
1.3.3 干茶色泽测定
采用L*a*b*表色系统，色差计法直接测定干茶色泽。使用前先用白板校正，每次手持分光测色仪任取3个点测定即时色差，每个点重复3次取平均值用于统计分析。其中L*代表亮度；
a*代表红绿色度，正值表示红色，负值表示绿色；
b*表示黄蓝色度，正值表示黄色，负值表示蓝色。a*及b*决定其色彩度，b*/a*决定其色相。
1.3.4 茶汤味觉值测定
采用电子舌采集茶汤的传感器响应值。取上述感官审评茶汤制备液约40 mL/份，共3份，倒入专用量杯中，将其放入电子舌自动进样器上，数据采集序列为校准溶液和待测茶汤交替进行，重复测量3次，求其3次的平均值作为各传感器响应值的原始数据，然后进行味觉值转换得到相应味觉值。
1.3.5 品质成分测定
水浸出物含量根据GB/T 8305-2013中的减压抽滤法测定[8]。可溶性糖含量采用蒽酮-硫酸比色法测定[8]。叶绿素含量采用混合液法测定[9]，取0.2 g过40目筛的茶粉，浸泡于乙醇:丙酮:水=4.5:4.5:1（V/V/V）的浸提液中，黑暗提取24 h。过滤后滤液在663 nm和645 nm波长下比色。利用Arnon公式计算茶叶所含叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量。茶多酚含量根据GB/T 8313-2018中的福林酚法测定[10]，以没食子酸作校正标准定量茶多酚。游离氨基酸含量根据GB/T 8314-2013中的茚三酮比色法测定[11]。
儿茶素组分和咖啡碱含量的测定采用高效液相色谱法[10]。色谱柱为Agilent TC-C18；
流量0.8 mL/min，柱温35 ℃，进样量5 μL，检测波长278 nm；
流动相：A相为超纯水（含0.1%甲酸），B相为甲醇；
洗脱梯度：0～2 min：80% A；
2～6 min：75% A；
6～10 min：70% A；
10～13 min：75% A；
13～23 min：70% A；
23～25 min：75% A；
25～30 min：80% A。
氨基酸组分测定的测定采用液质联用色谱法[12]。色谱柱为Waters T3色谱柱；
流量0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量1 µL；
流动相：A相为0.1%甲酸，B相为乙腈（含0.1%甲酸）；
洗脱梯度：0～3 min：1% B；
3～6 min：1%～4% B；
6～7.5 min：4%～90% B；
7.5～9.3 min：90% B；
9.3～9.4 min：90% B～1% B；
9.4～12 min：1% B。质谱条件：离子化模式ESI+，检测方式多反应检测（MRM），气帘气：35 psi；
喷雾电压：5.5 kV；
离子化温度：450 ℃；
Gas1：40 ℃；
Gas2：40 ℃。
1.3.6 抗氧化能力测定
羟自由基（·OH）清除能力的测定：参考Halliwell等[13]描述的方法，将水杨酸用体积分数20%的无水乙醇溶解后配成6 mmol/L备用，其余试剂用水稀释。硫酸亚铁铵溶液为6 mmol/L，过氧化氢溶液为8 mmol/L。依次加入反应液后混合，室温静置30 min，测定510 nm处的吸光度，每组重复3次。羟自由基（·OH）清除能力测定时分别将茶汤样品稀释至12、10、5、1、0.1 mg/mL。自由清除率计算：
式中：
F1——羟基自由基清除率，%；
A0——试剂本底吸收值；
（1）基础能力：城乡规划中空间发展与数据依据之间关系的分析是基础能力。以往的定性分析，以及美学为基础的评判标准，已经不符合存量规划中，以问题为导向，以解决经济、社会、生态等多方面效率优化为目标，就不得不借助数据分析工具进行评判，这也使得城乡规划专业借助数据分析判断，成为基础的设计能力。
Ax0——茶汤背景吸收值；
Ax——自由基反应体系吸光度。
DPPH自由基（DPPH·）清除能力的测定：参考Brand等[14]方法加以改进。将DPPH用体积分数95%乙醇稀释成40 mg/L的溶液,再以乙醇调整其浓度，使溶液在517 nm处的吸光度保持在0.600～0.700。测定517 nm处吸光度，每组重复3次。DPPH自由基（DPPH·）清除能力测定时分别将茶汤样品稀释至100、50、25、10、5 μg/mL。自由基清除率计算：
式中：
F2——DPPH自由基清除率，%；
Ax——样品管的吸收值；
Acontrol——对照管的吸收值。
总抗氧化能力（T-AOC）测定：依照测定试剂盒说明书规定方法进行。Trolox是一种VE的类似物，具有和VE相近的抗氧化能力。Trolox的总抗氧化能力为1，相同浓度情况下，其他物质的抗氧化能力用其抗氧化能力和Trolox相比的倍数来表示。
1.4 数据处理
试验所得的数据使用Excel 2016和SPSS 22.0软件分别进行数据计算和显著性分析（p＜0.05）。每个样本重复三次，数据以平均值±标准差表示。
表1 不同杀青处理对绿茶感官品质差异Table 1 Sensory quality of green tea produced by different fixation ways
2.1 龙井43、白叶1号、黄金芽所制秋季绿茶的品质成分测定
对滚筒杀青所制龙井43、白叶1号、黄金芽秋季绿茶进行品质成分分析，结果表明（图1），秋季绿茶水浸出物含量普遍很高，均大于40%。而茶多酚、游离氨基酸、咖啡碱的含量因品种而差异显著，其中龙井43茶多酚含量最高为26.87%，且拥有最高的咖啡碱含量，滋味较苦涩；
黄金芽秋季绿茶的氨基酸含量显著高于龙井43和白叶1号，且含有最低的茶多酚含量（17.23%）和最低的咖啡碱含量（2.25%），干茶滋味更醇和鲜爽。因此相较于普通常绿茶树资源，黄金芽即便在秋季，仍具有较高的氨基酸和较低的茶多酚，是良好的秋季茶树资源。
图1 不同品种绿茶主要品质成分含量Fig.1 Contents of main quality components of different varieties green tea
2.2 不同杀青处理对黄金芽绿茶感官品质影响
黄金芽绿茶感官审评结果如表1所示，三种杀青方式所制黄金芽秋季绿茶均品质优异。不同杀青方式对外形、香气、滋味、叶底得分影响较大，而汤色得分差别不大。滚筒杀青总体得分高于微波杀青和蒸汽杀青。香气上，滚筒杀青和微波杀青均呈栗香。滚筒杀青机的排湿风机可使桶内水蒸气顺势排出，防止水闷气的产生，更利于形成高长的栗香。微波杀青则由于叶温升温过快，抑制了茶叶内含物质的转化，过早固定了茶叶品质，致使香气未能充分发挥[6]，因此香气不如滚筒杀青。蒸汽杀青是将一定温度和压力的水蒸气直接作用于鲜叶，在湿热作用下将蛋白质水解成氨基酸[15]，所以香气类型有所不同，属清香型。但由于水汽不能及时排走，使得闷气明显，香气品质较差；
滋味评分上，蒸汽杀青滋味醇厚，得分最高（88），其次依次为滚筒杀青、微波杀青；
参考国家标准对黄金芽绿茶进行外形审评，滚筒杀青和微波杀青处理后的干茶色泽较绿，蒸汽杀青较好的保留了黄金芽的品种特性而色泽黄绿，外形得分较低。针对黄金芽的黄化特性，进一步通过L*a*b*表色系统对黄金芽干茶色泽进行分析，来综合全面评价黄金芽绿茶的色泽品质。
2.3 不同杀青处理对黄金芽绿茶色泽品质的影响
表2 不同杀青处理对绿茶色泽品质差异Table 2 Color index of green tea produced by different fixation ways
L*a*b*表色系统颜色均匀，与人类视觉相一致，广泛用于茶叶色泽测定。不同杀青处理对茶叶热作用的方式不同，对叶绿素的破坏和折损程度也不一样，色泽品质（表2）的结果显示，不同杀青方式对干茶L*、a*、b*/a*值影响显著。微波杀青绿茶的干茶色泽L*值最高，色泽鲜亮，可能是由于水分散失方向与热传递方向一致，内外失水均匀，因此叶质柔软，叶色绿[16]；
蒸汽杀青处理的a*和b*/a*均为正值，表明干茶色泽由红色调和黄色调搭配而成，色泽偏黄，更好的突出了黄金芽色泽优势。但由于有红色调占比，干茶色泽稍暗沉，这可能是由于杀青过程中水蒸汽直接与鲜叶接触，在湿热作用下更多的叶绿素a/b被降解（叶绿素a含量为1.29 mg/g，叶绿素b含量为1.65 mg/g），导致绿色素与黄色素含量比值显著降低，色泽黄绿，与感官审评结果相符；
滚筒杀青处理的干茶色泽a*值最低，b*/a*为负且绝对值最低，表明干茶色泽由黄绿色调搭配而成，绿色度最高。
2.4 不同杀青处理下黄金芽绿茶电子舌检测
通过电子舌进行滋味分析，可以看出黄金芽绿茶在不同杀青方式下的涩味、回味-涩味、鲜味、丰度差异性较大，甜味、苦味差异较小，其中酸味、咸味、回味-苦味的味觉值低于人体的味觉阈值，饮用时不能感受到差异。蒸汽杀青的鲜味值和丰度最大，苦味值最小，与感官审评滋味得分最高相吻合。微波杀青的甜味值和苦味值最大，涩味值与鲜味值最小。涩味的回味与涩味保持一致（表3）。
表3 不同杀青处理对绿茶电子舌检测的差异Table 3 Electronic tongue detection of green tea produced by different fixation ways
2.5 不同杀青处理对黄金芽绿茶主要品质成分影响
水浸出物含量能表明内含物质的丰富度，氨基酸、茶多酚、咖啡碱和可溶性糖是茶叶滋味的呈味物质。如表4所示，不同杀青方式对黄金芽绿茶的咖啡碱、氨基酸、可溶性糖和叶绿素含量均有显著性影响，对水浸出物、茶多酚和没食子酸含量影响较小。
表4 不同杀青处理下绿茶主要品质成分含量Table 4 Contents of main quality components of green tea produced by different fixation ways
其中水浸出物含量在40.33%至44.59%之间，咖啡碱含量在27.91至31.53 mg/g之间。滚筒杀青的氨基酸含量最高达到47.32 mg/g，分别比蒸汽杀青和微波杀青高11.01%和5.20%，这可能是由于滚筒杀青鲜叶升温由表及里相对缓慢[17]，蛋白质水解更加充分。茶多酚含量最低为172.28 mg/g，分别比蒸汽杀青和微波杀青低3.54%和3.94%。微波杀青的可溶性糖含量为23.24 mg/g，显著高于滚筒杀青和蒸汽杀青，但滚筒杀青和蒸汽杀青差别不大。滚筒杀青的叶绿素含量显著高于蒸汽杀青和微波杀青。滚筒杀青的叶绿素a含量比蒸汽杀青和微波杀青高42.33%和17.09%，叶绿素b含量比蒸汽杀青高17.27%。
表5 不同杀青处理下绿茶儿茶素组分含量Table 5 Contents of catechin component of green tea produced by different fixation ways
儿茶素是茶叶多酚类的主体，约占茶多酚总量的70%～80%，是构成茶叶涩味的主要成分[18]。分为酯型儿茶素（EGCG、ECG、GCG、CG）和非酯型儿茶素（GC、EGC、C、EC），酯型儿茶素是茶叶涩味的主体，含量一定时，对绿茶品质形成更为有利[19]。从表5中可以看出不同杀青处理的黄金芽绿茶的EC和C含量无显著差异，而ECG和EGCG含量在不同处理间差异最为显著。而ECG和EGCG含量又以微波杀青处理为最高，ECG含量分别高于滚筒杀青和蒸汽杀青2.66%和8.91%。EGCG含量显著高于滚筒杀青和蒸汽杀青处理3.62%和1.73%。同时微波杀青的茶多酚（179.34 mg/g）和儿茶素总量也较高，可能是因为杀青时鲜叶内部和表面同时升温，能迅速钝化酶活，阻止多酚类的氧化，同时形成茶叶必要品质特征的湿热作用没有充分进行[20]，所以滋味要稍差一些。Susanne等[21]研究表明EGCG活度值下限大于3，而EGC、ECG、EC、GCG 4种儿茶素的阈值上限大于1，因此主要贡献茶汤苦味强度。使得苦味儿茶素含量微波杀青最高（6 7.4 9 m g/g），蒸汽杀青最低（64.82 mg/g）。GCG和CG只在蒸汽杀青处理中有检出，其他两种处理均未检出。
表6 不同杀青处理下绿茶氨基酸组分含量（mg/g）Table 6 Contents of aminoacid component of green tea produced by different fixation ways (mg/g)
可溶性氨基酸含量是构成茶叶品质的关键及评价茶叶品质的重要指标，同时也是影响茶汤滋味的重要因子[22]。氨基酸根据滋味可归为滋味相关类、鲜爽类、甜味类、芳香类、苦味类，各类之间氨基酸种类有所交叉，可在一定程度上解释氨基酸对茶汤滋味的贡献[23]。茶氨酸是茶树中特有的氨基酸，也是含量最高的游离氨基酸，其含量占茶树中氨基酸总量的40%～60%，是茶叶鲜爽味的主要来源[24]。从表6中可以看出，不同杀青方式影响黄金芽绿茶中氨基酸组分含量。蒸汽杀青处理的黄金芽绿茶茶氨酸含量最高达到7.69 mg/g，占游离氨基酸总量的47.66%。谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和茶氨酸均属于鲜爽味氨基酸，可协同增强茶叶的鲜爽味[25]。丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸属于甜味氨基酸[26]。组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸属于苦味氨基酸[27]。不同处理的苦味氨基酸占游离氨基酸总量的10.26%至10.86%。蒸汽杀青的茶氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸含量均比其他处理的含量高，因此丰富度强，滋味醇厚，结果均与感官审评和电子舌检测得分相一致。
2.6 相关性分析
品质成分的差异是引起成茶感官品质的关键，因此对不同杀青方式黄金芽绿茶的感官审评和品质成分、电子舌滋味属性强度和滋味化学成分含量分别进行相关性分析，结果如表7。黄金芽秋季绿茶的感官审评总得分与茶多酚和酯型儿茶素含量均为显著负相关（p＜0.05），表明秋季黄金芽绿茶的茶多酚和酯型儿茶素含量越高，感官审评总分越低，苦涩味则相对较强。没食子酸和茶氨酸与滋味则表现出正相关，相关系数为0.92和0.90，但相关性不显著（p＞0.05）。
表7 相关性分析Table 7 Correlation analysis
根据电子舌滋味属性进一步研究发现，黄金芽绿茶的鲜味值与茶氨酸和鲜味氨基酸含量均表现为正相关，与茶氨酸含量相关性显著（p＜0.05），表明茶氨酸含量越高，鲜味得分越高，但与鲜味氨基酸相关性不显著。可能是因为人的味觉神经对于不同呈味物质的敏感程度不同[28]，因而呈味氨基酸的含量越高，对滋味的贡献不一定越大。同时多滋味属性的氨基酸存在互作，可表现为协同、加和、抑制效应[29]。例如低于呈味阈值的苦味氨基酸可增强其他氨基酸的鲜味和甜味[30]；
苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸能增加呈味的复杂性和辅助提升鲜度[31]；
咖啡碱能够增强茶氨酸的鲜味，少量降低茶氨酸的甜味，而茶氨酸却少量降低咖啡碱的苦味[32]。因此呈味氨基酸的呈味特性有时不够显著；
EGCG和ECG是儿茶素中苦味阈值较低的酯型儿茶素[33]，加上较高含量的咖啡碱，使得微波杀青苦味较重。通过相关性分析发现黄金芽绿茶的苦味值与咖啡碱和苦味儿茶素含量有显著正相关性（p＜0.05）。通常儿茶素含量即可较好地对茶汤苦味进行量化，即茶汤苦味强度主要由儿茶素含量决定；
而茶汤涩味的呈现较为复杂,需综合考虑儿茶素、咖啡碱、没食子酸、黄酮醇苷、氨基酸等组分才可对其涩味有较好的量化，即儿茶素涩味并非完全由儿茶素含量决定[34]。
2.7 不同杀青处理下黄金芽绿茶的抗氧化能力
抗氧化能力是体现茶叶保健功效的重要指标，茶多酚、氨基酸、黄酮等是主要的功效因子，可有效清除自由基，抑制活性氧的形成[35]。由表8可知，杀青方式对黄金芽绿茶总抗氧化能力有显著影响，对清除羟自由基和DPPH自由基的能力影响不显著。茶汤浓度为400 μg/mL时，总抗氧化能力由强至弱依次为微波杀青＞蒸汽杀青＞滚筒杀青＞对照，这与不同杀青处理的绿茶儿茶素含量存在显著正相关（p=0.05），相关系数为0.99。说明茶叶提取物的抗氧化活性与茶多酚含量呈现良好的量效关系，茶多酚含量越高，抗氧化活性越强[36]。滚筒杀青、蒸汽杀青和微波杀青的黄金芽绿茶清除·OH的IC50值无显著差异。
表8 不同杀青处理下绿茶清除自由基的能力Table 8 Free radical scavenging ability of green tea produced by different fixation ways
蒸汽杀青和微波杀青的黄金芽绿茶清除DPPH·的IC50值无显著差异，但显著高于滚筒杀青，表明滚筒杀青对DPPH·的清除能力高于蒸汽杀青和微波杀青。但总抗氧化力与自由基清除力之间并没有直接对应关系，说明茶叶中除儿茶素外还有更多具有自由基清除力的成分，且对于不同的自由基，不同的成分作用不同[37,38]。
不同杀青方式由于热量传递介质不同，瞬时热量传递的速度和温度都将影响到茶叶内含物质的转化，从而影响到茶叶的色泽、滋味和香气。本研究发现，三种杀青方式所制黄金芽秋季绿茶均品质优异，这是由于相较于普通常绿茶树资源黄金芽即便在秋季，仍具有较高的氨基酸和较低的茶多酚，有助于收敛性降低、鲜爽度增加。但经过滚筒和微波处理后的黄金芽鲜叶，外观颜色由黄转绿，蒸汽杀青则更好的突出了黄金芽色泽优势。不同杀青方式的秋季黄金芽绿茶香气特征有所不同。滚筒杀青和微波杀青呈栗香，且滚筒杀青优于微波杀青，而蒸汽杀青则有水闷气，香气品质较差。
利用黄金芽秋季原料试制绿茶，结果表明绿茶品质优异，为秋季茶树资源利用提供了新思路。滚筒杀青的黄金芽绿茶香气高长，滋味醇和，且滚筒杀青机操作简单、功效高，是大部分茶叶生产企业已经配备的杀青设备，故采用滚筒杀青是加工传统黄金芽绿茶较为经济的选择。采用蒸汽杀青则可使黄金芽绿茶滋味更加醇厚，且充分利用了黄金芽芽叶金黄的竞争优势，如能进行精深加工，创制符合消费者需求的新产品，则能产生更好的经济效益。
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