杨赛赛，吴庆华，陈 心，史惠蓉，任淑敏，焦智慧，翟仪稳
郑州大学第一附属医院妇产医学部遗传与产前诊断中心 郑州 450052
肾脏多发囊肿、肝脏囊肿及全内脏反位等是一组涉及多系统的纤毛疾病的较为常见的表现[1]。纤毛是从大多数哺乳动物细胞表面伸出的毛状结构，为细胞表面细胞器，被连续的细胞膜包裹，中心有一微管轴丝。真核细胞纤毛和鞭毛的组装通过鞭毛内转运(intraflagellar transport,IFT)过程完成。纤毛装配缺陷或纤毛信号传导障碍均可导致纤毛相关疾病。该类疾病临床表型变异广泛并具有遗传异质性，几乎影响机体的每一个系统，如脑、眼、肝脏、肾脏、骨骼、生殖系统以及内脏左右对称发育等[2]，多为人类发育性或退行性相关疾病。基因诊断是明确其遗传学病因的最精准方法。本研究采用全外显子组测序的方法对一例包括肾脏与肝脏多发囊肿、全内脏反位、肾功能不全、右侧精囊缺如及甲状腺功能不全等为主要特征的患者行基因筛查及家系分析，为深入了解该罕见疾病的临床表型及病因学，以及为该家庭遗传咨询和生育相关指导提供了明确的遗传学依据。
1.1 研究对象先证者，男，15岁，因“乏力1个月，发现肾功能异常3 d”就诊。入院后完善相关检查。血液学检查示：尿素21.2 mmol/L(正常值2.2～8.2 mmol/L)，肌酐714 μmol/L(正常值20～115 μmol/L)，胱抑素C 3.78 mg/L(正常值0.40～1.55 mg/L)，β2微球蛋白18.13 mg/L(正常值0.00～3.00 mg/L)，α1微球蛋白74 mg/L(正常值10～30 mg/L)，总蛋白48.3 g/L(正常值60.0～85.0 g/L)，球蛋白11.9 g/L(正常值20.0～35.0 g/L)，红细胞计数2.64×109个/L(正常值4.30×109～5.80×109个/L)，血红蛋白83.0 g/L(正常值130.0～175.0 g/L)，降钙素原0.20 ng/L(正常值0.00～0.06 ng/L)，甲状旁腺素138.94 ng/L(正常值4.09～17.71 ng/L)，N末端B型利钠肽原200.56 ng/L(正常值0.00～34.06 ng/L)。尿潜血(+)，尿蛋白(+)，尿葡萄糖(±)。超声检查提示右位心，内脏反位，肝囊肿，双肾弥漫性回声改变并双肾囊肿。64层CT平扫结果(图1)显示镜面右位心，心脏增大、心包腔少量积液；
双侧胸腔少量积液，双肺下叶慢性炎症；
肝、胆、脾、胃反位，肝脏、双肾多发囊肿，右侧精囊缺如。心电图示：部分导联ST段改变。先证者父母及弟弟身体健康，家族中无遗传病史。该家系经遗传咨询后，要求行遗传学检查并签署知情同意书。
A：镜面右位心(心尖朝右)；
B：肝、胆、脾、胃反位；
C：肝脏多发囊肿；
D：双肾多发囊肿；
E：右侧精囊缺如
1.2 遗传学检查
1.2.1DNA提取 采集先证者及家系其他成员的外周血各2 mL，采用北京天根公司的DNA提取试剂盒提取基因组DNA(gDNA)，采用Qubit 2.0荧光计(Termo Fisher Scientifc公司,美国)对DNA样本进行定量。
1.2.2全外显子组测序 应用Illumina DNA Flex LPK Enrichment文库制备和富集试剂盒对片段化的gDNA进行文库构建，然后采用Illumina NovaSeq 6000测序平台(美国)PE150模式进行测序。20×覆盖度达到95%，平均测序深度不少于100×，捕获效率不低于80%，读长150～200 bp。使用Illumina DRAGEN Bio-IT平台将测序原始BCL数据拆分为FASTQ文件，采用上海瀚垚生物医学亿解基因数据解读系统(简称EGIS系统)进行变异注释和解读。采用Sentieon软件进行基因序列比对和基因变异分析；
采用Sentieon软件组件进行基于数据层面包括测序数据质量、比对率、深度、覆盖度等，进行变异初步过滤；
采用SNPEFF软件进行变异信息注释，通过与已知的和基因功能相关的多种数据库，如OMIM、ClinVar、人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database,HGMD)、dbSNP、GnomAD等，对变异进行注释;采用EGIS系统多种数据解读工具进行临床数据解读，包括bpVast智能筛选、bpPheno表型筛选、bpCNV Scan CNV变异分析、bpBAM在线分析等工具，对变异数据结合临床表型和相关数据库注释信息等进行分析，判断变异与疾病和表型关联的优先级顺序。
1.2.3PCR扩增及Sanger测序 对全外显子组测序筛查出的可疑致病突变位点应用PCR扩增及Sanger测序进行验证。应用Primer 5设计引物，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用ABIBigDye 3.1测序试剂盒在ABI3130X基因测序仪上对产物进行双向测序，SnapGene软件将测序结果与正常序列进行比对分析，验证基因突变位点。对发现的基因突变，依据HGMD及PubMed文献搜索以确定是否为新发突变；
依据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)最新基因变异数据解读指南对突变的致病性进行分析。
2.1 全外显子组测序结果先证者携带IFT172基因c.4630C>T(p.R1544C)和c.4120T>C(p.W1374R)复合杂合突变。
2.2 Sanger测序及致病性分析Sanger测序结果见图2。Sanger测序结果确定先证者IFT172基因的这两个突变分别来自其父母，先证者弟弟未携带这两个突变位点。IFT172基因c.4630C>T(p.R1544C)突变在HGMD专业版数据库中已有报道，为致病性变异；
IFT172基因c.4120T>C(p.W1374R)突变为错义变异，未见其致病性的相关报道，根据ACMG指南，该变异判定为疑似致病性变异，包括2个中等证据(PM1+PM3)+3个辅助证据(PP3+PP4+PM2)。综合临床表型，认为该基因突变为该家系先证者的致病原因的可能性大。
图2 患者及正常对照Sanger测序结果
IFT复合体包含20多种IFT蛋白，可以分为IFT-A和IFT-B，IFT-A及其驱动蛋白均已被证明与人类纤毛病相关，特别是与骨骼发育不良相关；
IFT-B包含14个亚基，在人类疾病中的作用尚不清楚。在IFT过程中，大的蛋白颗粒通过微管被驱动蛋白和动力蛋白运送，参与纤毛和鞭毛的安装、维持[3]。IFT也参与Shh、Wnt等信号传导和细胞周期调控[4-6]。纤毛蛋白编码基因或其相关信号通路的基因突变可导致纤毛病变，表现为复杂的多器官系统发育障碍。根据临床表型和主要受累器官，可以分为肾病相关性纤毛病与骨骼性纤毛病[7]。肾病相关性纤毛病临床表现为慢性肾病或慢性肾炎，并导致终末期肾病而需进行肾移植，部分患者表现为肾脏早期囊性发育不良、肝纤维化等；
骨骼性纤毛病包括Ellis-Van Crevel综合征、窒息性胸营养不良(Jeune 综合征)、Mainzer-Saldino综合征和多指综合征等。
本家系中先证者具有纤毛疾病相关的典型临床表现，包括多囊肾、多囊肝及全内脏反位等，但纤毛疾病种类多且临床表现重叠，难以明确其具体疾病类型，遗传学检查确定其携带IFT172基因c.4630C>T(p.R1544C)和c.4120T>C(p.W1374R)复合杂合突变，分别来自正常临床表型的父母。IFT172基因c.4630C>T(p.R1544C)突变的致病性在HGMD专业版数据库中已有报道，与短肋胸廓发育不良伴或不伴多指综合征10型(short-rib thoracic dysplasia 10 with or without polydactyly,SRTD10)有关，软件预测显示为有害，综上并根据ACMG指南，该变异判定为致病性变异。IFT172基因c.4120T>C(p.W1374R)突变为未报道过的新突变，该突变为错义变异，软件预测其有害，根据ACMG指南判定其为疑似致病性变异。综合临床表型，认为该突变为先证者致病原因的可能性大，从病因上得以明确诊断。
短肋多指综合征(short-rib polydactyly syndrome,SRPS)是一组由纤毛功能障碍引起的常染色体隐性或双基因隐性骨骼发育不全综合征，SRTD10是其中的1种类型。IFT172蛋白属于IFT-B，其突变是SRTD10的唯一病因，导致的纤毛疾病在临床上较为罕见，到目前为止相关病例报道极少。IFT172基因编码的膜相互作用蛋白，是纤毛发生所必需的最大的细胞IFT亚基。与其他纤毛疾病类似，IFT172基因突变导致的临床表现具有异质性，可以骨骼系统异常为主要表现或以非骨骼系统表现为主要表现，骨骼系统异常可见多指畸形、长骨短、胸廓发育不良等[8]；
非骨骼系统异常可见全内脏反位、慢性肾病、肝肾囊肿、视网膜色素变性、小脑蚓部发育不全、肥胖、甲状旁腺功能亢进等[9]。本研究中先证者肝脏及双肾多发囊肿、右位心、全内脏反位、肾功能不全、肾性贫血、甲状旁腺功能亢进、右侧精囊缺如，而无明显的骨骼系统发育异常。
IFT172基因缺陷也可导致除SRTD10外的其他遗传综合征，如Jeune综合征和Mainzer-Saldino综合征[9]。经典Jeune综合征是由IFT80和DYNC2H1基因突变引起的，常不表现出骨骼外症状[10]；
IFT140基因突变是Mainzer-Saldino综合征和Jeune综合征的常见原因，常伴有多种骨骼外病变，包括肾消耗疾病(nephronophthisis,NPHP)、视网膜变性和肝脏异常等[11-12]。而由IFT172基因突变导致的Jeune综合征具有复杂的表型，常累及骨骼外系统，特别是NPHP、肝纤维化、视网膜变性、肥胖等，大多数患者在儿童时期表现为NPHP伴进行性肾功能不全，并在20岁之前发展为终末期肾病[7]。
肝脏及肾脏多囊性改变和内脏反位等是纤毛疾病的典型且常见表现，然而，纤毛疾病种类繁多且有相似的临床症状，仅根据临床表现不能明确病因，高通量测序是一种特异、高效的基因筛查手段，可作为疑似纤毛病患者的第一线检查方法，对于家庭遗传咨询、疾病随访和治疗以及生育相关指导具有重要的应用价值。
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