，赵应龙，吴静楠，李锦，蔡懿琳，杨莎莎，张以芳，柴俊
(1.寻甸县塘子街道办事处农业综合服务中心畜牧科，云南 寻甸 655203；
2.永平县杉阳镇农业综合服务中心畜牧兽医组，云南 永平 672607；
3.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)
禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)引起的禽类败血性传染病[1]。可引起鸡、鸭、鹅等禽类的死亡。禽霍乱主要侵害3月龄以上的禽类，性成熟后的禽类最易感，高产母鸡感染后死亡率最高[2]，近年来，巴氏杆菌在禽类养殖中有流行的趋势[3]。本试验对昆明地区送检的病鸡样品进行检测，通过细菌分离鉴定确定病原菌并进行药敏试验，为禽多杀性巴氏杆菌的鉴别诊断及抗s菌药物选择提供依据。
1.1 病料来源
样品来源于昆明地区某养鸡场送检的疑似巴氏杆菌感染的病鸡6只。
1.2 主要试剂与仪器
血琼脂培养基、微量生化鉴定管、瑞氏染液、革兰氏染液、药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司，DNA提取试剂盒、PCR试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司。根据GenBank公布的多杀性巴氏杆菌的基因组序列，应用Oligo 7软件设计一对针对kmtI基因的特异性检测引物，上游引物序列为F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物为R-GCTGTAAACGAACTCGCCAC，大小为460 bp，引物由擎科生物公司合成。
1.3 细菌的分离纯化及染色镜检
无菌采取病鸡的肺、心脏、肝脏等脏器组织在营养肉汤中用37℃摇床进行过夜培养，用灭菌的接种环接种于血琼脂培养基中37℃恒温培养18～24h,纯化培养后，进行瑞氏-吉姆萨染色和革兰氏染色镜检。
1.4 生化试验
将纯化培养菌液接种在葡萄糖、蔗糖、木糖等微量生化鉴定管。按产品说明书操作并观察结果。
1.5 菌株的PCR鉴定
纯培养菌液1mL于Eppendorf管中，沸水浴中加热3min，进行PCR，其反应体系为25μL体系：包括2×Taq Super Mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、菌液2μL、ddH2O 8.5μL。反应程序为94℃预变性5min，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min循环30次，72℃再延伸10min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像系统下观察电泳条带。阳性样品胶回收送擎科生物科技有限公司进行测序，利用DNAStar生物学软件将测序序列与GenBank中基因序列分别进行核苷酸同源性比较分析。
1.6 药敏试验
取100μL纯培养菌液移至1%的血清营养琼脂上，并用无菌L棒涂布菌液，贴上药敏片置于37℃恒温箱中培养18～24h。测量抑菌圈直径，判定标准：抑菌圈直径>15.1mm为高敏(S)，10.1mm≤直径≤15.1mm为中敏(L)，<10.1mm为耐药(R)。
分离细菌经分离纯化、染色镜检、生化试验、PCR鉴定及测序，确诊为多杀性巴氏杆菌。
2.1 细菌分离与表型鉴定结果
分离纯化接种血琼脂培养基，37℃恒温培养24h，在血琼脂上生成灰白色、露珠样的菌落，菌落周围无溶血现象，如图1所示。瑞氏染色经镜检可见两端着色较深、周边有荚膜的小杆菌，如图2所示。
图1 血琼脂培养基的分离纯化
图 2 瑞氏染色镜检
2.2 生化试验结果
细菌生化培养可利用葡萄糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖，产酸不产气，不能利用肌醇、乳糖，可产生硫化氢，能形成靛基质。MR和V-P试验均为阴性，接触酶和氧化酶试验均为阳性，尿素酶阴性，不液化明胶，与巴氏杆菌特性相符。
2.3 PCR产物电泳鉴定及测序结果
培养细菌利用巴氏杆菌kmtI基因的特异性检测引物进行基因扩增，PCR产物进行凝胶电泳鉴定，结果显示出与预期的试验结果相符(460 bp)的特异性目的条带(图3) 。利用DNAStar生物学软件将扩增的kmtI基因序列与GenBank中的巴氏杆菌kmtI基因序列分别进行核苷酸同源性比较分析，同源性为100%。
2.4 药敏试验及结果
分离菌株对环丙沙星、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、新霉素、卡那霉素、复方新诺明、呋喃唑酮、氯霉素、氟苯尼考、阿米卡星、麦迪霉素共14种抗菌素高敏。对氨苄西林、头孢氨苄、青霉素、克林霉素、米诺环素、多粘菌素、庆大霉素共7种抗菌素中敏。对氧氟沙星、万古霉素、红霉素、四环素、诺氟沙星、林可霉素、多西环素、苯唑西林共8种抗菌素有耐药性。
禽巴氏杆菌多为条件性致病菌，大多数是内源性感染，当动物机体抵抗力下降时常引起发病。因此，对该病的防控主要以提高动物机体抵抗力和做好饲养管理工作为主。云南气候类型为亚热带季风气候，光照条件较好，降雨日数多，相对湿度较大。通风不良会使禽舍内阴暗潮湿，易滋生细菌，使禽患病的风险加大[4,5]。
多杀性巴氏杆菌的耐药性因地域存在差异性。分离菌对四环素类、喹诺酮类药物等有耐药性，耐药基因的产生可能是饲养过程中长期滥用四环素类和喹诺酮类药物所致，为适应生存环境，变异出抵抗该类抗菌药物的菌群。临床治疗多杀性巴氏杆菌时，应结合药敏试验结果，选用合适的抗菌药物如环丙沙星、头孢唑啉、头孢呋辛等以增加治疗效果，减少鸡场经济损失，同时减少耐药菌株的产生[6]。
禽巴氏杆菌危害严重，依据免疫程序按时注射疫苗，可大大降低该病的发生率，有效预防该病在规模化养殖场暴发。我国鸡巴氏杆菌病疫苗主要是菌苗, 但因多杀性巴氏杆菌血清型多 (16种) 、交叉免疫力低, 导致疫苗免疫效果不理想。但王华等人从分离出的鸡多杀性巴氏杆菌基于其毒力因子外膜蛋白 (OMP) 制成亚单位疫苗, 较菌苗免疫效果好[7]，为禽霍乱有效预防提供科学依据和可行性。另外，多杀性巴氏杆菌属于条件致病菌，因此，需要搞好养殖场的环境卫生，对鸡舍做好消毒管理，及时通风透气，同时饲料添加维生素和饲喂蛋白质饲料，增加鸡群的免疫力，可有效避免鸡场禽霍乱的暴发。
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