郑慧敏，陈跃来，蔡君豪，李之豪，李珊珊，宓轶群＊＊
（1.上海中医药大学附属中医医院 上海 200071；
2.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032）
前列腺癌根治术后尿失禁（Radical Prostatectomy Urinary Incontinence，RPUI）是前列腺癌患者术后最常见的并发症，主要类型是压力性尿失禁，表现为体位改变、腹压增高等原因导致小便不自主漏出[1]。随着我国医疗水平提高和国民健康意识增强，近20年来通过各种筛查手段，发现患有前列腺癌的患者比率显著上升，相比1997年上升7-8倍[2]。根据早诊断早治疗原则，诊疗指南推荐根治性前列腺切除术是治疗局限性前列腺癌最有效的方法（I，A）[3]，越来越多前列腺癌患者接受手术治疗，这也势必造成术后尿失禁的高发，据流行病学调查显示[4-5]患者术后拔除导尿管近期内均存在不同程度的尿失禁，尽管漏尿程度会随盆底组织恢复而改善，术后3个月仍有42%的患者存在尿失禁，而术后1年以上尿失禁患病率可达16%，在我国RPUI的发生率约2%-87%。RPUI患者需长期佩戴尿垫，不便长途旅行，畏于参加社交，容易产生抑郁自卑的负面情绪，严重影响患者的身心健康及生活质量[6]。
RPUI目前无特效药物治疗，术后早期只能通过盆底肌功能锻炼、生物反馈等保守治疗，术后一年仍有严重尿失禁者可行二次手术重建尿道盆底结构[7]。虽然泌尿外科微创技术突飞猛进，相比常规手术具有切除范围小，对盆腔组织损伤少等诸多优势，术后护理及围手术期尿失禁宣教工作也在日益精进，但术后尿失禁的发生率并无下降趋势[8-9]。术后尿失禁的主要原因是内源性括约肌功能障碍（Intrinsic Sphincter Deficiency，ISD）和 尿 道 过 度 移 动（Urethral Hypermobility，UH）[10]，前列腺癌根治术过程中不可避免地损伤了尿道括约肌、缩短膜性尿道导致尿道闭合压下降可能是发病机制，也有学者认为膀胱过度活动和盆腔自主神经丛的损伤也会造成术后尿失禁[11]，RPUI到底是属于单纯性外周神经肌肉组织损伤，还是与中枢内分泌有关有待进一步研究[12]。
我们前期研究发现电针可改善女性压力性尿失禁患者的漏尿频率和漏尿量，疗效不劣于作为一线治疗方案的西药联合盆底肌训练[13]，针灸对尿道功能有显著调节作用，通过尿动力学等评价方法，证实针刺可使尿失禁患者尿道闭合压力上升，改善尿失禁症状[14]。根据中医“异病同治”理论，针刺治疗也可改善RPUI的程度和频率[15]。为了进一步研究电针控尿机制，课题组拟开展关于电针干预RPUI模型大鼠的实验研究，然而却发现RPUI的研究热点多集中前列腺癌根治术方式改良及针对尿失禁的保守治疗和二次手术临床疗效评估，关于电针治疗RPUI的临床和基础研究较少，因此有必要开展相关研究，而稳定成熟的动物模型对探索该疾病生理病理基础以及针刺控尿有重要意义。为此，本研究拟通过评估RPUI动物模型稳定性，为进一步研究电针治疗尿失禁的控尿机制提供模型依据。
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物及分组
选用SPF级雄性SD大鼠24只，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，许可证号码：SCXK（沪）2018-0004。实验大鼠体质量180-200 g，6周龄，采用SPSS软件生成随机数后将大鼠分成空白组、假手术组和模型组，每组8只，每笼4只。饲养于上海中医药大学动物房，饲养温度20-23℃，湿度60-70%，所有实验大鼠均给与正常饮食饮水常规饲养，入组3天后进行基线评估及造模等处理。本研究通过上海中医药大学动物伦理委员会审批，伦理编号：PZSHUTCM210820007。
1.1.2 主要实验仪器和试剂
德国充电式电凝止血器，型号：HARDOX400；
Polaris多光谱组织切片扫描仪；
加拿大Laborie-Medical-Technology公司BONITO型尿动力学分析仪；
Masson三色染色试剂盒，南京海克尔生物科技有限公司；
1%戊巴比妥钠溶液，上海中医药大学动物实验中心提供。
1.2 实验方法
1.2.1 造模方法
模型组参照尿道括约肌电灼伤法进行造模[16]，将大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（0.4 mL/100 g）麻醉后仰卧于保温垫上，捆绑四肢，固定头部，下腹部备皮，定位耻骨联合后沿下腹部正中线纵行切口2-3 cm，逐层剪开皮肤及下腹部肌肉，游离膀胱、前列腺和尿道近端组织，于耻骨联合后缘处找到定位近端尿道和两侧的尿道括约肌组织，接通电凝止血器电源（50 w，600 Hz，强度3），充分加热刀头至红色后在两侧尿道括约肌（长度约2 cm）进行电灼伤，每侧尿道括约肌等距离灼伤4个点，每点灼伤持续时间1 s以建立RPUI模型，逐层缝合关闭腹腔，术后3天预防性应用抗生素，于第10天和第17天进行模型评估。
假手术组麻醉后打开腹腔暴露膀胱前列腺及尿道组织，不接通电凝止血器电源，仅用常温电凝刀头触碰尿道括约肌两侧而不进行电灼伤，逐层关闭腹腔后常规饲养，预防性应用抗生素，各项指标评估时间同模型组。
空白组不采取任何干预措施，常规饲养，同样抓取，各项指标评估时间同模型组。
1.2.2 指标观察
一般情况：观察雄性SD大鼠体重、饮食、精神状态和活动情况，术后腹部切口有无炎症反应及渗出等。
喷嚏试验：采用尿动力学检测仪测量最大膀胱容量（Maximal Bladder Capacity，MBC）及漏尿点压力（Leak Point Pressure，LPP），采用腹部按摩法排空大鼠膀胱，注入一半MBC容量混有美兰染液的生理盐水，剪取鼠须轻扫大鼠鼻孔诱发喷嚏反射，观察有无蓝色液体从尿道口流出。若有蓝色液体流出则喷嚏试验阳性，否则阴性。由于RPUI属于压力性尿失禁，喷嚏试验用于检测模型是否成功。
尿动力学测定：大鼠麻醉后取仰卧位，用腹部按摩法排空膀胱后暴露阴茎“m”型骨性标志，将实验用动物导尿管头端蘸取石蜡油，用止血钳固定阴茎远端后插入导尿管，遇阻后将阴茎往头侧略微倾斜，导尿管向尾侧轻探深入，有落空感后继续往里插直至出现第二次落空感，导尿管插入总深度约4 cm左右，微量泵以0.3 mL·min-1的速度向膀胱内注入无菌生理盐水；
同时，尿动力学检测仪校“0”并开始检测。当尿道口出现第一滴液体时，停止灌注，计算MBC＝灌注时间×灌注速度，此刻标记处为LPP；
每只大鼠反复拔除导尿管排空膀胱后重新留置导尿，尿动力学检测共3次，取平均值。三组大鼠于入组后第3天（造模当天）、第10天（造模后1周）、第17天（造模后2周）进行尿动力学检测。
尿道括约肌组织形态学观察：入组后第10天采用过量注射1%戊巴比妥钠麻药安乐死，开腹定位膀胱，剪去耻骨联合后游离并剪取近端尿道组织，浸泡于4%多聚甲醛溶液静置3d进行组织固定，石蜡包埋切片后采用Masson染色，观察实验大鼠尿道括约肌组织形态学结构。
1.3 统计学方法
使用SPSS24.0软件进行统计学分析，计数资料用N（%）表示，计量资料均以±s表示，计数资料采用Fisher确切概率法；
计量资料采用方差齐性检验与正态性检验，符合正态分布的多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验；
不符合正态分布或各组方差不齐的采用非参数检验的Kruscal-Wallis法，如果检验结果有统计学意义，则进一步作两两比较，采用Bonferroni法校正P值，然后用成组的Wilcoxon检验。以P＜0.05为差异有统计学意义，两两比较以P＜0.017为有统计学意义。
2.1 一般情况
实验共24只雄性SD大鼠，每组8只，其中模型组1只大鼠于造模后半小时死亡，考虑原因为术中大出血导致脏器衰竭；
另1只于第7天死亡，考虑术后感染可能；
假手术组1只大鼠第7天出现拱背现象，精神萎靡，无二便，考虑术后感染，第8天死亡，开腹探查发现盆腔组织黏连明显。剩余21只大鼠反应灵敏，活动正常，饮水、饮食良好，大便干燥、量正常，在不同观察时间点三组大鼠之间体重比较无统计学差异（P＞0.05）。模型组大鼠手术伤口愈合好，未见红肿渗液。大鼠体重情况见表1。
表1 各组大鼠体重平均值比较（±s，g）
注：组间比较，各观察时间点三组大鼠比较，P＞0.05。
组别空白组假手术组模型组第3天例数第10天例数体质量（g）235.75±5.75 243.92±3.78 231.07±2.32体质量（g）289.64±6.14 291.01±4.23 283.38±4.98体质量（g）187.78±4.63 185.67±3.54 182.24±4.12第17天例数8 8 7 8 7 6 5 4 3
2.2 喷嚏试验结果
第6天实验大鼠喷嚏试验结果：空白组和假手术组喷嚏试验均为阴性；
模型组有4只大鼠喷嚏试验阳性，模型组与空白组、假手术比，喷嚏试验差异有统计学意义（P=0.026＜0.05），结果见表2。
表2 各组大鼠喷嚏试验结果
2.3 尿道括约肌组织形态学结果
尿道括约肌组织形态学染色结果：各组大鼠在第10天随机挑选3只取材后进行Masson染色，从图中可见空白组和假手术组大鼠尿道组织在4倍镜下见尿道结构完整，尿道外括约肌包膜光滑无破裂，10倍镜下可见尿道括约肌纤维结构排列紧密整齐，无明显充血及炎性渗出（图A、图D，图B、图E）；
模型组大鼠尿道组织在4倍镜下见尿道外括约肌组织结构松散，红色箭头所指处可见细胞间质炎性渗出伴血肿，结缔组织增生，10倍镜下见尿道外括约肌肌纤维排列结构紊乱，而尿道横纹括约肌结构完整排列尚整齐（图C、图F）。
2.4 尿动力学检测结果
3组大鼠尿动力学检测结果显示：组内比较，模型组第10天MBC较第3天降低，差异有统计学意义（P＜0.017），第10天LPP较第3天降低，差异有统计学意义（P＜0.017），第17天与第3天比无统计学差异（P＞0.017）；
空白组、假手术组第3天、第10天和第17天之间比较MBC和LPP差异无统计学意义（P＞0.017）；
组间比较，模型组第10天MBC较假手术降低，差异有统计学意义（P＜0.017），模型组第10天LPP较假手术降低，差异有统计学意义（P＜0.017）；
造模后第3天、第10天和第17天空白组和假手术组MBC和LPP比较无统计学差异（P＞0.05）；
通过以上结果我们发现采用尿道灼伤法造模可在术后1周内降低雄性SD大鼠MBC和LPP，结果见表3-表4和图2-图3。
图1 各组大鼠近端尿道组织Masson染色结果
图2 各组大鼠最大膀胱容量测定结果比较
图3 各组大鼠漏尿点压测定结果比较
表3 各组大鼠最大膀胱容量平均值比较（±s，mL）
表3 各组大鼠最大膀胱容量平均值比较（±s，mL）
注：组内比较，与第3天比较，*P＜0.017；
组间比较，与假手术组比较，△P＜0.017。
组别空白组假手术组模型组第3天例数第10天例数第17天例数MBC（mL）0.95±0.14 0.97±0.23 0.72±0.18 8 8 8 MBC（mL）0.91±0.14 0.90±0.09 0.95±0.18 8 7 6 MBC（mL）0.98±0.12 0.93±0.21 0.42±0.19△*5 4 3
表4 各组大鼠漏尿点压平均值比较（±s，cmH2O）
表4 各组大鼠漏尿点压平均值比较（±s，cmH2O）
注：组内比较，与第3天比较，*P＜0.017；
组间比较，与假手术组比较，△P＜0.017。
LPP（cmH2 O）90.43±3.84 87.35±4.95 86.22±5.43组别第3天例数LPP（cmH2 O）86.42±3.52 82.36±4.82 82.81±5.32第17天例数第10天例数空白组假手术组模型组8 8 8 8 7 6 LPP（cmH2O）88.68±4.32 86.33±3.43 51.98±4.58△*5 4 3
压力性尿失禁高危因素主要包含年龄、肥胖、分娩、雌激素改变等，所以临床上在正常人群中，女性压力性尿失禁的患病率要比男性高出3-5倍。女性多胎分娩及围绝经期雌激素变化使压力性尿失禁患病率明显上升[17]，男性由于较长的膜性尿道结构和膀胱颈尿道口特殊解剖结构，使得患压力性尿失禁的概率较低。然而前列腺癌根治术为了减少切缘阳性率，需要进行完整前列腺以及膀胱颈、尿道括约肌、精阜等组织的切除，同时清扫盆腔淋巴结，即使目前先进的机器人腹腔镜手术中最大程度保留控尿神经血管束核盆底结构，但重建膀胱颈和尿道使得男性正常盆腔结构遭破坏无可避免[18]。早在上世纪国外学者通过“整体理论”和“吊床理论”强调盆底韧带肌肉及内脏筋膜等组织复杂的互相作用形成一个动态平衡的盆底支撑结构，而不是简单的各部分组织结构累加，该结构对维持下尿路正常控尿机能上发挥重要作用，雌性压力性尿失禁大鼠造模方法主要通过模拟产伤、尿道灼伤等破坏盆底结构来构造尿失禁的病理状态[19]，手术操作难度不高、模型稳定性可，有了简便稳定的动物模型后女性盆底障碍性疾病手术也产生了飞跃性进展。而雄性尿失禁动物模型的类型较少，目前只有大鼠、小鼠有相应的模型制作方法，但缺乏统一的评价标准，因此我们需要通过该疾病的临床特征，结合相应的理化检查来建立和评估相应动物模型的稳定性，并根据干预方式的特点选择合适的动物模型来研究疾病的生理病理机制。
根据RPUI临床特征，患者切除前列腺的同时缩短膜性尿道长度、损伤尿道括约肌及其支配神经、破坏盆底组织结构，术后短期内发生尿失禁的原因主要是由于手术导致尿道括约肌功能减退、膜性尿道缺失造成盆底组织结构失衡，通过盆底肌功能训练、生物反馈等治疗可改善漏尿症状，超过12个月后由于盆底组织疤痕增生、尿道括约肌纤维化等原因，导致尿失禁难以自行恢复而需通过二次手术、干细胞注射等治疗方案来重塑盆底结构[20]，由于手术过程中切除了整个前列腺和膀胱颈，术后膜性尿道长度即重建后的膀胱颈到阴茎球部尿道距离减少，可导致重塑后的膀胱颈位置下移、尿道括约肌变薄变短，再加上术后长时间留置导尿引起尿道外括约肌麻痹和松弛，以上这些原因均是导致盆底结构破坏、尿道闭合压下降，最终影响RPUI患者控尿能力[21]。在治疗上保守治疗首推盆底肌功能锻炼，然而来自Cochrane的系统综述中表明盆底肌功能训练只能加速尿失禁恢复，并不能提高术后尿失禁的有效率[22]，对术后尿失禁的有效治疗主要集中在人工括约肌置入、阴茎袖套等二次手术上。但二次手术高昂的费用及患者明显的心理负担又使手术开展率低下。
针灸作为一种保守治疗的方法自古就有记录可治疗排尿功能障碍性疾病。《灵枢·癫狂》：“内闭不得溲，刺足少阴、太阳于骶上以长针。”古代医家认为长针透刺腰骶部特定腧穴后可通过循经感传，调节膀胱经气，振奋膀胱机能，达到固涩止遗之效。腰骶部腧穴所对应的脊神经节段主要为S2-4，与盆神经进入骶髓排尿中枢的部分重合，有调节膀胱和尿道括约肌的作用，针刺腰骶部腧穴对下尿路排尿功能障碍具有双向调节作用，既可降低膀胱过度活动症患者的逼尿肌兴奋性，又可提高压力性尿失禁患者的尿道阻力，因此针灸治疗泌尿系统疾病的机制可能为提高了膀胱尿道的顺应性[23]。课题组前期研究发现电针刺激雌性压力性尿失禁大鼠骶尾部腧穴对尿道括约肌功能有着显著的调节作用，通过尿动力学等评价方法，证实针刺可降低膀胱内压，提高尿道闭合压，而根据“异病同治”理论又进行了男性尿失禁的临床小样本观察，发现同样的配穴方案也可改善男性RPUI患者术后尿失禁程度。为了进一步研究针刺控尿机制需要选择适合的尿失禁动物模型，鉴于针灸治疗需要一定疗程，所选模型稳定性非常重要，稳定性过低会导致后期自愈倾向出现假阳性结果，若造模时对模型形成不可逆损伤尽管长效稳定，但对针灸治疗可能会出现假阴性结果，此类模型更适用于神经肌肉再生性研究而不适合针灸。为此，我们亟需寻找适合研究针刺控尿的RPUI动物模型，并选择合适的下尿路评估方法，这对泌尿系统疾病的机制探索和治疗方案评估非常重要[24]，因为合理规范、客观科学的评估方案同样对研究电针治疗尿失禁动物模型的控尿机制及临床推广意义重大。
本研究采用尿道括约肌电灼伤法进行造模，该方法模拟了患者手术过程中电凝刀对盆底组织造成的灼伤状态，电灼伤对大鼠两侧尿道括约肌造成直接损伤外还破坏了贴在尿道两侧的神经血管等组织，本造模方法操作简单、可重复性高，模型大鼠会出现ISD表现，符合术后尿失禁的临床病理特点，然而本法也存在一定局限性，电灼伤主要是肌源性损伤，无法复制根治术过程中可能发生的所有损伤，为此我们将进一步寻找更符合RPUI病理机制和发病过程的造模方法用来探索针刺控尿的疗效判定。本研究通过观察喷嚏实验阳性率、尿道括约肌组织形态学观察和尿动力学测定来评估模型稳定性。喷嚏试验在模型组阳性率不高（57.14%），与空白组、模型组相比差异有统计学意义，偏低的阳性率可能与样本量小、大鼠性别、麻醉大鼠仰卧位测量有关，戊巴比妥钠麻醉时间、麻醉量、大鼠精神状态等各项指标也可能影响喷嚏试验，喷嚏试验通过诱发喷嚏模拟腹压增高状态检验模型大鼠漏尿情况，与压力性尿失禁患者临床表现最相符，团队前期研究中，通过模拟产伤法制备雌性SD大鼠压力性尿失禁模型后进行喷嚏试验，阳性率约67.8%左右，RPUI模型大鼠的喷嚏试验结果可作为判定模型成功的参考指标并非主要指标，模型建立成功与否需进一步行组织学观察及尿动力测定。Masson三色染色是对胶原、结缔组织经典的染色法，在Masson染色中胶原纤维、结缔组织等会呈蓝色，胞浆肌肉、纤维素等呈红色，细胞核呈蓝黑色，大鼠尿道解剖结提示膀胱、前列腺、尿道构成的尿路系统存在丰富的弹力纤维如盆底筋膜及尿道悬韧带，这些组织含有丰富胶原在Masson染色下更能清晰地被识别，我们前期研究发现雌性压力性尿失禁大鼠盆底组织中的I、III型胶原较正常大鼠减少，故本研究采用Masson染色法观察RPUI模型中尿道括约肌形态。通过观察我们此次实验中尿道组织的Masson染色的组织学图片可发现SD大鼠的尿道括约肌分为内层的尿道横纹肌以及外层的尿道外括约肌，内侧的横纹肌组织与尿道壁结缔组织并非有清晰的隔膜而是互相嵌插重叠的，当横纹括约肌收缩时可封闭尿道来提高尿道压防止漏尿。Masson染色的特殊显示可见尿道上皮及尿道横纹括约肌周围分布大量胶原纤维，尿道括约肌呈Ω状附在尿道周围，尿道括约肌细胞比普通骨骼肌细胞小，这些排列紧密的肌纤维参与了尿道支撑结构，对控尿发挥重要作用，当排尿时由骶髓初级中枢发出神经冲动控制尿道括约肌开阖使尿道膀胱颈开放以利小便排出。尿道周围的括约肌受损影响接受来自中枢神经支配时，就无法完成主动收缩或被动协调盆底支撑结构联动作用。模型组大鼠由于尿道外括约肌受到电灼伤，肌纤维出现明显病理改变，因此造成控尿能力降低，且术后形成疤痕组织较难恢复如初，后期控尿能力的恢复并非尿道括约肌功能恢复，而是通过尿道平滑肌、盆底支撑组织功能代偿来改善尿失禁。我们对第3、10、17天的尿动力分别进行检测，结果发现模型组大鼠第10天MBC和LPP均降低，但第17天尿动力数据趋于正常组数据，出现这种情况可能的原因有以下两点：①SD大鼠身体自我修复能力强，第17天大鼠已经出现自愈倾向，因此尿动力学结果趋于正常；
②由于雄性SD大鼠尿道较雌性大鼠长，且有两次生理狭窄，尿动力检测需要反复进行导尿管插管，这将对雄性大鼠尿道造成损伤，损伤可表现为尿道粘膜水肿增加了尿道闭合压，本次研究第17天三组大鼠中均出现不同程度的尿道损伤，具体表现为导尿管插入过程中反复遇阻、尿道出血等，尿动力测定的MBC和LPP值可能呈假阴性，最终统计结果出现测量偏倚，今后可通过增加样本量或改良尿动力检测方式来提高数据质量。有研究者采用腹压漏尿点压结合最大尿道闭合压对RPUI患者进行尿动力学检测发现上述方法可以良好的评估尿道括约肌功能，是前列腺根治术后评价尿失禁可行的方案[25]，在雌性尿失禁动物模型上也证实腹压漏尿点压和逆行漏尿点压均能客观评估尿失禁程度[26]，然而缺乏雄性尿失禁大鼠相关指标的评价研究，今后研究可采用顺行尿动力检测以避免对远端尿道的损伤程度，减少实验误差，提高数据客观性。
综上所述，尿道括约肌电灼伤法可以成功建立RPUI大鼠模型，模型具有可重复性，且该模型症状、病理和尿动力均符合术后尿失禁患者临床表现及体征，是研究RPUI的理想模型。模型建立后7天内稳定性较高，我们通常采用电针治疗尿失禁模型大鼠的时间是5天左右，因此本模型适用于研究电针控尿的近期疗效，而远期疗效评估则需选择长效稳定的动物模型。本实验首次采用喷嚏实验结合尿道括约肌组织学涂片及尿动力检测等方法来评估RPUI动物模型稳定性，并对尿动力检测可能存在的测量偏倚进行深入分析。目前关于RPUI的研究热点多集中前列腺癌根治术方式改良及临床疗效评估，电针作为保守治疗方法之一，尚缺乏严谨的随机对照研究[27]，同样也缺少相关的电针控尿机制研究，因此，为了进一步开展电针治疗RPUI的临床和基础研究，动物模型的稳定性至关重要，今后我们将在此实验基础上改良尿动力评估方法，同时对模型动物中枢神经系统与外周盆底组织的神经传导递质进行探索，拟为下一步验证电针治疗尿失禁的控尿机制和作用靶点提供可靠的实验依据。
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