王丽焕，郭文娟，钱晓明
（1.天津工业大学纺织科学与工程学院，天津 300387；
2.天津工业大学 化学工程与技术学院，天津 300387）
艾草（Artemisiaargyi），菊科蒿属植物，分布于我国的东北、华北、华东、华南和西南等各省区，资源非常丰富，是一种广泛应用的中药材[1]。艾草，全草入药，具有温经、祛湿、散寒、止血、抑菌、抗虫和抗氧化等功效，药圣李时珍称其为草医，也有草中钻石的称号[2]。现代对艾草的药理研究显示，艾草具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗氧化等药理作用，因此，开发出了具有抑菌、增强免疫力等功效的产品，如艾灸条、艾叶贴等[3]。基于艾草的活性成分和药理作用，使艾草纤维具有天然保健功能。
艾草改性竹黏纤维是将艾草提取液混入竹黏纤维纺丝液中，经纺丝及后处理得到的新型纤维，其中艾草提取液在纤维中的质量占比约为10%[4]。艾草改性竹黏纤维面料具有良好的吸湿排汗、清凉透气和穿着舒适性，广泛应用于儿童服装、家纺、内衣、T恤衫、防护服饰等领域，具有广阔的市场前景[5-7]。钱晓明教授等[8-9]利用艾草作为抗菌成分，制备抗菌纤维取得了良好效果。然而在艾草纤维的制备阶段，添加艾草提取物时，因受到各种因素的限制，往往只是添加艾草水提取物，甚至是艾草药材的细粉，严重影响了艾草抗菌效果的发挥。国内外学者对艾草的化学成分进行了较为广泛的研究，发现艾草中化学成分主要为：挥发油类，如月桂烯[10]、水芹烯[11]、石竹烯氧化物[12]、桉油精、樟脑等[13]；
黄酮类，如异泽兰黄素、柚皮素[14]、高车前素[15]、洋芹素[16]等；
以及多糖类、苯丙素类等。其中，黄酮类化合物在艾草中已发现有50余种，被认为是艾草抗菌的主要活性成分[17]。
本文应用超声波辅助提取技术，采用单因素实验与响应曲面分析法相结合，对艾草总黄酮的最佳提取工艺进行研究，以期得到抗菌性良好的艾草总黄酮提取物，为艾草提取物在纺织工业领域的应用提供理论依据。
1.1 材料、试剂与仪器
材料与试剂：干燥艾草，采自湖北蕲春（2018年）；
芦丁对照品，上海源叶生物科技有限公司产品；
无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯，市售。
仪器：Q-250B3型高速多功能粉碎机，上海冰都电器有限公司产品；
AR224CN型电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司产品；
KQ-100B型超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司产品；
ZNCL-G型智能磁力搅拌器，巩义市英峪高科仪器厂产品；
UV2600型紫外-可见光分光光度计，日本岛津公司产品。
1.2 艾草总黄酮的超声提取方法
艾草粉碎后过筛，称取2.000 g干粉，按一定料液比加入一定体积分数的乙醇水溶液，在一定温度下浸泡5 min，在超声波清洗机中提取一定时间，抽滤，弃去残渣，合并滤液，取滤液作为供试品溶液。
1.3 紫外分光光度法测定总黄酮含量[18-19]
（1）首先，绘制芦丁标准曲线。准确称取芦丁标准对照品5.0 mg放入锥形瓶，用体积分数50%的乙醇水溶液溶解，移入50 mL容量瓶定容至刻度线处，摇匀即可得到0.1 mg/mL的芦丁标准液。然后分别准确量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，定容，得到不同浓度的对照品溶液。各对照品溶液分别取2.0 mL至10 mL容量瓶中，分别加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀后静置6 min，再加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后静置6 min，再加入4%氢氧化钠4 mL，用60%的乙醇稀释至刻度，摇匀后静置12 min，以试剂作空白参比液，采用紫外可见光分光光度计于507nm处测吸光度，以芦丁浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。由芦丁标准曲线可知，A=9.834 4C，R=0.999 9，表明线性关系良好。
（2）再测定总黄酮的含量。精密量取5.0 mL艾草滤液转移到100 mL的容量瓶中，用体积分数60%的乙醇水溶液定容至刻度。再精密量取2.0 mL艾草/乙醇溶液，按照（1）中方法测定艾草总黄酮的吸光度，并计算艾草中总黄酮的提取率RT（mg/g）。
式中：A1为样品溶液的吸光度；
C0为标准样品的浓度；
M为稀释倍数；
V1为样品溶液的体积；
A0为标准样品的吸光度。
1.4 单因素实验
称取2.000 g艾草，考察粉碎粒度、乙醇体积分数、超声波提取时间、料液比、提取温度、提取次数等对艾草中总黄酮提取率的影响，每组实验进行3次，应用SPSS11.0统计软件Duncan"s multiple range test进行多组样本间的差异显著性分析。
1.5 响应面实验
在单因素实验结果的基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理设计自变量，以艾草总黄酮提取率为响应值，通过响应曲面分析，对超声波辅助提取艾草中总黄酮的工艺条件进行优化。利用响应面软件分析进行实验，分别测定总黄酮提取率，将实验结果与实验方案相比较，得到总黄酮实际平均提取率。
2.1 单因素实验结果
2.1.1 艾草粉碎粒度对艾草总黄酮提取率的影响
取不同目数10、20、40、60、80、100目的艾草颗粒粉末，分别准确称取2.000 g，按1∶20（g∶mL，下同）的料液比加入体积分数50%的乙醇溶液中，提取温度为（20±5）℃，超声提取20 min，结果如表1所示。
由表1可知，颗粒度为10～100目时，从艾草中提取的总黄酮量呈现先减后增的趋势，100目时艾草中的总黄酮提取率达到最大值132.03 mg/g，且与其他粉碎度比较具有极显著性差异。这是由于艾草的粉碎粒度越小，艾草总黄酮越易溶出，符合一般规律。
表1 粉碎粒度对艾草总黄酮提取率的影响Tab.1 Effects of crushing degrees on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi
2.1.2 乙醇体积分数对艾草总黄酮提取率的影响
准确称取100目艾草粉末2.000 g，料液比为1∶20，乙醇体积分数分别为0、10%、30%、50%、70%、90%，温度为（20±5）℃，超声提取20 min，结果如表2所示。
表2 乙醇体积分数对艾草总黄酮提取率的影响Tab.2 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi
由表2可知，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮的提取率呈现出先增加后降低的趋势，当乙醇体积分数达到50%时艾草中总黄酮的提取率达到最高110.38 mg/g。艾草总黄酮为一类中等极性化合物，易溶于醇-水系统，极性过大或者过小都不适合总黄酮的提取。本实验结果显示，最适合的提取溶剂是体积分数为50%的乙醇水溶液。
2.1.3 超声时间对艾草总黄酮提取率的影响
准确称取100目艾草粉末2.000 g，料液比为1∶20，乙醇体积分数50%，提取温度为（20±5）℃，超声提取时间分别为20、40、60、80 min，实验结果如表3所示。
由表3可知，超声时间对总黄酮的提取量影响不显著，超声时间为40 min时总黄酮提取率达到最大值113.96 mg/g，但与20 min之间没有显著性差异。超声时间80 min后，总黄酮的提取量有所下降，其原因可能为提取时间延长，某些成分被破坏所致。因此，选择20 min为最佳超声时间。
表3 提取时间对艾草总黄酮提取率的影响Tab.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi
2.1.4 料液比对艾草总黄酮提取率的影响
准确称取100目艾草粉末2.000 g，乙醇体积分数50%，提取温度为（20±5）℃，料液比（g/mL）分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶30，超声提取20 min，结果如表4所示。
表4 不同料液比对艾草总黄酮提取率的影响Tab.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi
由表4可知，料液比为1∶10～1∶30时，艾草中总黄酮的含量随着料液比的增加而逐渐递增，在1∶30时提取率达到116.47 mg/g，且与其他组别存在显著性差异。料液比越大，使用的溶剂量越多，对艾草总黄酮的提取有益。
2.1.5 提取次数对艾草总黄酮提取率的影响
准确称取100目艾草粉末2.000 g，料液比为1∶20，乙醇体积分数50%，提取温度为（20±5）℃，超声提取20 min，提取次数分别为1、2、3、4次，结果如表5所示。
表5 提取次数对艾草总黄酮提取率的影响Tab.5 Effect of extraction times on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi
由表5可知，艾草中总黄酮的提取量随着提取次数的增加而增大，提取4次时总黄酮提取率达到最大值142.63 mg/g，但提取4次和提取3次之间没有显著性差异。提取次数的增加会增加总黄酮的提取量，但提取次数过多会造成能源和溶剂的浪费。因此，本文选择提取3次为最佳条件。
2.1.6 提取温度对艾草总黄酮提取率的影响
准确称取100目艾草粉末2.000 g，料液比为1∶20，乙醇体积分数50%，提取温度分别为20、40、60、80℃，超声提取20 min，结果如表6所示。
表6 提取温度对艾草总黄酮提取率的影响Tab.6 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids from Artemisia argyi
由表6可知，随着提取温度的升高，艾草中总黄酮的提取率逐渐增加，提取温度为80℃时总黄酮的提取率达到最大值159.33 mg/g。当温度升高时，分子扩散运动加快，有利于艾草总黄酮的溶出和提取。
2.2 响应面法优化艾草总黄酮的提取工艺
2.2.1 响应面实验结果
根据单因素实验结果，提取温度、乙醇体积分数及料液比对艾草总黄酮的提取率影响较大。因此，本文选择提取温度（A）、乙醇体积分数（B）和料液比（C）作为自变量，以艾草总黄酮提取率（RT）为评价指标，根据Box-Behnken中心组合设计原理，通过Design-Expert 8.0 5b软件设计三因素三水平实验，因素水平表如表7所示，响应面实验设计[20]及结果如表8所示。
2.2.2 回归方程的建立及模型方差分析
使用Design-Expert 8.0 5b软件对表8数据进行二次多元拟合处理，得到回归方程：
表8 响应面实验设计及其结果Tab.8 Design and results of response surface experiment
对该回归模型进行方差分析，结果如表9所示。
表9 回归模型方差分析Tab.9 Variance analysis of regression model
由表9可知，F=41.65，P<0.000 1，说明该模型的显著性较高。失拟项P=0.004 8<0.01，表现为极显著；
校正确定系数R2=0.971 5，说明该模型能解释97.15%的响应值变化，拟合程度良好，能够较好地反应超声提取温度、料液比和提取溶剂（乙醇）与总黄酮提取率的关系；
模型响应值的变异系数CV=3.13%，表明实验操作重复性好（<10%）。由此说明，可以用该模型对总黄酮提取率进行分析和预测，各因素对总黄酮提取率的影响大小顺序为料液比>乙醇体积分数>提取温度。各因素对总黄酮提取率的交互影响不显著。
2.2.3 响应曲面分析
以总黄酮提取率为响应值进行响应曲面分析，根据响应面软件可以得到各因素对总黄酮提取率的交互影响3D响应面图和等高线图，如图1—图3所示。
图1 提取温度与乙醇体积分数交互作用对总黄酮提取率影响的3D响应面图及等高线图Fig.1 3D response surface and contour map of interaction between extraction temperature and ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids
图3 乙醇体积分数与料液比交互作用对总黄酮提取率影响的3D响应面图及等高线图Fig.3 3D response surface and contour map of interaction between ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids
响应面越陡峭的一方，其对提取的影响越大。由图1可知，乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响大于提取温度的影响；
由图2可知，料液比对总黄酮提取率的影响大于提取温度的影响；
由图3可知，料液比对总黄酮提取率的影响大于乙醇体积分数的影响。由此可得，料液比对总黄酮提取率的影响最大，其次是乙醇体积分数，最后是提取温度，与方差分析所得结论一致。
图2 提取温度与料液比交互作用对总黄酮提取率影响的3D响应面图及等高线图Fig.2 3D response surface and contour map of interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids
2.2.4 最佳条件预测与验证
通过Design Expert软件进行数据拟合分析，得到最佳提取工艺为温度80.15℃、料液比1∶40.16（g/mL）、乙醇体积分数47.59%，在此条件下总黄酮提取率为169.32 mg/g。为了便于操作，选取提取温度为80℃，料液比为1∶40（g/mL），乙醇体积分数为50%，平行进行3组实验，对最佳工艺进行验证，结果表明总黄酮提取率为167.02 mg/g，与预测值基本吻合，说明预测模型可靠。
采用超声波辅助提取艾草总黄酮：
（1）单因素实验结果表明，艾草粉碎粒度越大，提取效率越高；
随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率先增加后降低；
超声时间对总黄酮提取率的影响不显著；
随着料液比、提取次数和提取温度的增大，艾草总黄酮的提取率逐渐增加。
（2）响应面实验结果表明，对总黄酮提取率的影响大小顺序为料液比>乙醇体积分数>提取温度，各因素对总黄酮提取率的交互影响不显著。本文所得预测模型可靠，可用该模型对总黄酮提取率进行分析和预测。
（3）结合单因素实验及响应曲面法分析，得到超声辅助提取艾草总黄酮的最佳工艺条件为艾草粉碎100目、乙醇体积分数50%、提取温度80℃、超声提取时间20 min、料液比1∶40（g/mL）、提取次数3次，在此条件下得到总黄酮提取率为167.02 mg/g。
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