叶丽芳，马志国,3，张 英,3，廖鹏程，黄天赐，付 伟，曹 晖,3*，吴孟华,3*
1暨南大学岭南传统中药研究中心，广州 511400；
2广东省中医药信息化重点实验室，广州 510632；
3国家中药现代化工程技术研究中心岭南资源分中心，广州 511400；
4九州天润中药产业有限公司，武汉 430050
中药材切制前常须软化，使其质地由硬变软，便于切制，润法是最常用的软化方法。“润在适中”“少泡多润，药透水尽”是老药工的经验总结，软化程度主要借助人的眼观、手感等感受来判断，具有一定的主观性。润制过程中，随着水分的渗透，药材内部多个指标出现了明显的变化，这些指标的量化表征对阐明中药传统润制经验的科学内涵具有重要意义。低场核磁共振(LF-NMR)和磁共振成像(MRI)具有灵敏度高、分析速度快、无创性、无破坏性和低成本特点[1]，用于物性分析的质构仪具有客观性、易操作等优点[2]，这两种技术可分别从水分和物性角度对食品加工过程与产品质量进行量化表征，在食品研究领域已广泛应用[2，3]。近年来，LF-NMR/MRI和物性分析技术在中药的产地加工和炮制研究中也得到了应用[4-9]，为中药传统润制经验科学内涵的研究提供了重要技术手段。
厚朴为木兰科植物厚朴MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.或凹叶厚朴MagnoliaoffcinalisRehd.et Wils.var.bilobaRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，具有燥湿消痰、下气除满的功效。作为皮类药材的代表之一，厚朴由药材到饮片的制备方法为“刮去粗皮，洗净，润透，切丝，干燥”[10]。切制前，厚朴润制程度的把握目前尚缺乏科学客观的指引，关于厚朴炮制的研究多以炮制前后化学成分变化为主[11，12]。本研究在厚朴润制吸水率变化曲线的基础上，对润制过程中水分分布、药材质构特性和主要有效成分含量的动态变化进行直观量化表征与相关性分析，旨在阐释厚朴润制“少泡多润，药透水尽”传统经验的科学内涵，为中药润制终点的准确判断提供依据。
1.1 仪器与设备
MesoMR23-060H-1中尺寸核磁共振成像分析仪(上海纽迈分析仪器股份有限公司)；
TA-HD plus 物性测定仪(英国Stable Micro System公司)；
XGQ-2000型恒温培养箱(余姚市星辰仪表厂)；
101-2AB电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；
Thermo Ultimate 3000 液相色谱仪，DAD检测器，四元低压梯度泵，在线真空脱气机，自动进样器，柱温箱(赛默飞世尔科技公司)；
FA 2204B型万分之一电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；
EX225DZH 十万分之一天平(奥豪斯仪器有限公司)；
KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 材料与试剂
厚朴酚(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：RFS-H00411801016，质量分数>98.0%)，和厚朴酚(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：RFS-H00511801016，质量分数>98.0%)；
甲醇购自上海麦克林生化科技有限公司，为色谱纯；
水为纯净水(华润怡宝饮料(中国)有限公司)；
其余试剂均为分析纯。
厚朴(批号：HP0101、HP0102、HP0103)购自湖北省恩施市宣恩县，经暨南大学药学院张英副教授鉴定均为木兰科植物厚朴MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.的干燥干皮。参考《76种药材商品规格标准 厚朴》中筒朴的规格标准，结合样品实际情况，以重量和长度为指标，将样品分档如下：筒长大于40 cm，且重量大于200 g者为大档；
筒长30～40 cm，且重量100～200 g者为中档；
筒长小于30 cm或重量小于100 g者为小档。
1.3 方法
1.3.1 润制过程水分变化研究
1.3.1.1 吸水率变化考察
称取不同档厚朴药材(含水量约为8%)各三份，每份300 g，洗净后，将药材置于泡药池内，加5 L水没过药材，浸泡0.5 h后，取出，转移至润药容器内，覆盖湿纱布，分别在10、20、30 ℃下堆润，润制过程中每1 h称重1次，计算各时间点的吸水率，直至药材充分软化。吸水率计算公式如下：
式中，Mt为不同润制时间厚朴的质量，M0为厚朴浸泡前的质量。
1.3.1.2 水分迁移分析
横向弛豫时间(T2)测定 取“1.3.1.1”项下不同润制时间的中档厚朴，吸干表面的水，称重，然后放入低场核磁共振(LF-NMR)久磁场中心位置的直径为60 mm的玻璃管中，利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列测样品T2，连续测定3次，取平均值。采用多脉冲回波序列CPMG扫描采集核磁信号，通过调整multi-slice spinechoes(MSE)序列中的选层梯度、相位编码梯度和频率编码梯度，分别获取样品俯视和正视成像数据，然后利用 sirt 算法，迭代次数为100 000次进行反演得到T2谱图。T2试验主要参数：主频SF=21 MHz，偏移频率O1=260 kHz，90°脉宽P1=10.00 μs，180°脉宽P2=19.04 μs，累加采集次数NS=4，回波时间TE=0.300 ms，回波个数NECH=8 000，采样频率SW=100 kHz[8]。
低场核磁共振成像(MRI)试验 采用多层自旋回波序列MSE采集T2测定项下各样品横断面的H质子密度图像[5]，采用MRI成像软件进行MRI成像试验。MRI成像参数：层数6，层厚2 mm，层间隙2 mm，采集次数16，重复时间260 ms，视野100 mm×100 mm，频率方向256，编码步数192。
1.3.2 润制过程质构特性分析[6]
2016年初，隆化县共有建档立卡贫困村152个，贫困户3.83万户共8.346万人，全县贫困人口人均可支配收入2900元。截至2017年底，隆化县还有贫困村152个，贫困户1.6484万户共4.2852万人，其中深度贫困村23个，贫困户2369户共6585人，两年减贫40608人。全县贫困人口人均可支配收入3100元，较2016年增长200元，同比增长6.9%，脱贫效果显著。2017年10月份，隆化县在河北省第三方评估中，以错退率1.31%、错评率1.89%、群众满意度98%的优异成绩位列河北省脱贫工作第一。
采用TA-HD plus物性测定仪，选用TA-9探头测定“1.3.1.1”项下不同润制时间中档厚朴的质构特性，为保证硬度测量精度和准确性，经预试验考察，发现触发、测试速度和测试深度为主要影响因素，因此分别对其进行考察，以期建立质构仪评价厚朴软化程度的方法。
测时速度考察：固定触发力与测试深度，测试速度水平为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mm/s，进行测时速度的单因素考察，各水平重复测定6次，结果平均硬度值分为：633.0、922.8、1 122.2、1 327.8、15 221.7 g，RSD依次为9.9%、5.8%、4.5%、6.9%、10.0%。结果发现不同参数水平的测时速度对平均硬度值略有影响，测时速度越快，平均硬度值越大，RSD差异明显，呈先减少后增大的趋势。测时速度为1.5 mm/s时，RSD值最小，因此测时速度设置为1.5 mm/s。
测试深度考察：固定触发力与测时速度，测试深度水平为6、8、10、12、14 mm，进行测试深度的单因素考察，各水平重复测定6次，结果平均硬度值分为：583.3、943.3、1 073.7、1 157.3、1 302.8 mm，RSD依次为22.6%、7.1%、6.1%、19.7%、12.8%。结果发现不同参数水平的测时速度对平均硬度值影响较大，测试深度越大，平均硬度值越大，RSD差异明显。测试深度为10 mm时，RSD值最小，因此测试深度设置为10 mm。
触发力考察：固定测试深度与测时速度，触发力水平为1、2、4、6、8 g，进行触发力的单因素考察，各水平重复测定6次，结果平均硬度值分为：1 014.0、1 128、1 334、1 705、1 851.3 g，RSD依次为8.0%、6.6%、6.3%、8.0%、22.0%。结果发现不同参数水平的测时速度对平均硬度值影响较大，触发力越大，平均硬度值越大，RSD差异明显。触发力为4 g时，RSD值最小，因此触发力设置为4 g。通过对质构仪测试条件的优化，确定最终测试参数为：测试速度1.5 mm/s，测试深度10 mm，触发力4 g。可获得物性指标有：样品硬度、压缩循环功、粘力、粘性、胶着性等。
1.3.3 润制过程指标成分变化考察
将“1.3.1.1”项下20℃下不同时间的厚朴小档样品分别取出，切丝，干燥，参照《中国药典》含量测定方法，分别测定各样品厚朴酚与和厚朴酚的含量[10]。
2.1 润制过程水分变化
2.1.1 吸水率变化曲线
以润制时间为横坐标，吸水率为纵坐标作图，绘制吸水率变化曲线(见图1)。
图1 10 ℃(A)、20 ℃(B)、30 ℃(C)厚朴吸水率变化曲线(n = 3)
2.1.2 润制过程中水分相态和分布状态的变化
通过连续分布的CPMG弛豫曲线的多指数拟合获得的T2分布如图2所示，每条曲线是3个样本的9次独立测量的平均值。T2图谱是测量H质子弛豫时间与信号幅度得到的图谱，横向的弛豫时间代表水分的自由度，H质子受束缚力越大或自由度越小，T2时间越短；
束缚力越小或自由度越大，T2时间越长。厚朴T2谱图上主要存在2种相态的水，其中T21(0.01～1 ms)代表结合水，T22(1～100 ms)代表自由水[13]。由图2，表1可知，在润制前，厚朴中T2图主要呈现的是T21峰，T21峰占比为92.82%，T22峰占比为7.18%，表明此时厚朴中以结合水为主，随着润制时间增加，T22峰面积快速增加且与T21峰黏连，表明此阶段主要增加的是自由水。总峰面积可以反映厚朴中水分含量的变化，随着润制时间增加，总峰面积不断呈上升趋势，表明厚朴内的水分含量在快速增加，此结果与吸水动力学结果一致。随着润制时间的增加，T2时间逐渐变大，表明厚朴中水分自由度变大，流动性增加。
图2 厚朴不同润制时间的T2谱
表1 厚朴润制过程中T21、T22和峰面积(A)的变化(n = 3)
2.1.3 润制过程中MRI图像变化
利用MRI成像技术可以直观地观察样品内部水分信息，H质子数量可以代表样品中的水分含量[13]。而所成图像的颜色表示H质子密度的高低，随着成像颜色由蓝色向绿色再向红色的转变，表示该处水分含量呈增加状态，颜色越蓝含水量越低，颜色越红含水量越高。由图3可知，干样状态的厚朴水分含量较低，几乎不能被检识；
随着润制时间的增加，水分由表皮向内渗透，成像越来越清晰并出现红色区域，8 h后厚朴内部大部分呈绿色，颜色也趋向均匀，此时与“软硬适宜、内外一致，内无干心”的传统判断标准一致。表明MRI成像技术与传统的终点判断方法有良好的相关性，可以作为指示润制终点的新方法。
图3 厚朴不同润制时间MRI图像
2.2 润制过程中质构特性分析
厚朴润制过程中样品硬度、压缩循环功、粘力、粘性、胶着性测定结果见表2；
同时，以穿刺时间X(s)为横坐标，穿刺针移动过程中的硬度Y(g)为纵坐标，绘制质构曲线，见图4。由表2、图4可知，吸水后厚朴质地随着润制时间的增加会发生显著变化，各物性指标均明显下降，但8 h之前，药材仍切制困难，内有干心，8 h时硬度降为569 g，压缩循环功降为31 900 kJ，此时便于切制，切开后断面无干心，与“软硬适宜、内外一致，内无干心”的传统判断标准一致，表明物性指标可作为判断厚朴润制终点的客观标准。
表2 不同润制时间厚朴的质构特性(n=3)
图4 不同润制时间厚朴的质构曲线
2.3 润制过程中指标成分含量分析
厚朴润制过程中指标成分含量变化情况见图5和图6。
0 h是对照组，其他不同润制时间样品与0 h进行对比，由图5和图6可知不同润制时间样品的指标成分含量与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)，且润制的时间越长，其显著性差异越大，说明润制过程中会导致指标成分流失，且润制时间越长，流失越多。
图5 不同润制时间和厚朴酚含量变化图
图6 不同润制时间厚朴酚含量变化图
2.4 验证试验
选取大中小档厚朴药材各三份，每份300 g，按照“1.3.1.1”项下润制方法在不同温度下进行润制，润透后，按照“1.3.2”项下方法测厚朴的质构特性。验证结果见表3。由表3结果可知厚朴大中小档达到润制终点时的吸水率在30%～50%，硬度值<600 g，表明吸水率和硬度可作为确定润制终点的重要客观指标。
表3 厚朴润制过程验证试验(n=3)
2.5 吸水率、水的相态、质构特性和指标成分含量的相关性分析
利用SPSS软件对厚朴润制过程中的吸水率、水分相态、质构特性和指标成分含量进行皮尔逊双变量相关性分析(见表4)。
表4 吸水率、水分相态、质构特性和指标成分含量的相关性分析
由表4可知，润制时间、吸水率、自由水和束缚水含量之间具有显著的正相关，相关系数分别在0.882～0.993；
硬度、压缩功和指标成分含量之间具有显著的正相关，相关系数在0.885～0.992；
润制时间、吸水率、自由水含量、束缚水含量与硬度、压缩循环功之间具有显著的负相关，相关系数在0.803～0.993。润制时间、吸水率、水分相态、质构特性和指标成分含量之间均有极显著的相关性，说明采用LF-NMR/MRI技术和质构仪可以较好表征润药过程的特点，考察的指标能合理的反映饮片质量。
干燥的皮类药材切制成饮片必须经过润制，润制的目的主要是使药材吸收一定量的水分，使药材质地由硬变软便于切制[14]。在中医临床调配处方或中成药生产必须使用饮片，厚朴药材经润制后切制成细丝状饮片。如未润制或润制不充分，厚朴药材硬度大，无法切制成丝，或润制伤水，有效成分大量流失，影响临床疗效，因此，对厚朴润制过程的研究至关重要。而传统润药终点的确定多以主观感受来判断，缺乏客观评判指标，对操作者的经验要求极高。本文将吸水率、水分分布MRI图、质构特性作为润制终点判断的重要指标，使润制结果不依赖人为主观判断，更加科学准确，可为智能化润药机的开发提供参考和数据支持。
从厚朴吸水实验结果得知，润制温度越高，润透时间越短，吸水率越大，可能是因为温度越高，水分子运动速率越快，渗入药材的速度也越快，进而导致药材软化速度加快，药材吸收的水分也就越多；
档次越小，润透时间越短，吸水率越大，除了与不同档次厚朴大小差异有关外，还可能与其生长年限不同而出现的质地差异有关，通常生长年限越长，木质化程度越高[15]，进而影响润制时的吸水能力。
LF-NMR/MRI技术可监控厚朴润制过程中自由水与束缚水的组成变化，直观显示水分由外而内的动态迁移行为，MRI成像技术可直观显示水分在药材中的分布，可直接判断药材软化程度，且与传统的终点判断方法有良好的相关性，可以作为指示润制终点的新方法。质构特性研究表明，不同润制时间的厚朴硬度、粘力、胶着性、压缩循环功等物性指标与润制程度密切相关且具有明显的差异，表明实时监控厚朴润制过程中物性指标的变化趋势，可作为判断润制终点的重要参考指标。这两种现代技术可作为润药过程水分控制和药材软化程度评价的重要手段。
目前，润药机只具备单一的润药功能，对润制过程药材的软化程度不能控制，缺乏在线检测系统，LF-NMR/MRI与物性分析技术可对软化程度进行评价，未来将LF-NMR/MRI与物性分析技术应用在润药机的在线检测设备中，可实现智能化润制。
本文采用LF-NMR/MRI、质构仪等现代技术对厚朴润制过程中吸水率、水分相态与迁移行为、质构特性变化和指标成分含量进行了客观表征和动态检测，直观表征了厚朴润制过程，分析了影响润制工艺的关键因素，为阐明厚朴润制传统经验的科学内涵和优选润制工艺提供了科学依据，为厚朴润制工艺优化和终点判断提供了重要的评价指标，也为其他皮类药材的润制研究提供了参考借鉴。
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