权利娜 王露 王嘉雯 姚晗博 刘航
(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046;2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000)
多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua，是百合科黄精属多年生草本植物，入药部位为根茎，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效，是《中国药典》2020版中黄精的来源之一[1]。多花黄精含有多糖、甾体皂苷、黄酮、生物碱类成分[2-3]，其中甾体皂苷具有增强免疫、降血糖、调血脂、抗肿瘤、抗抑郁等多种药理作用[4-5]，而上述药理活性均与抗氧化有关[6-12]，因此，本研究以总皂苷为评价指标，采用响应面法优化多花黄精的提取工艺，并对总皂苷的进行体外抗氧化活性评价，为多花黄精总皂苷的开发利用提供参考。
1.1仪器 CEL-S500旋转蒸发仪(德国IKA公司)；
CEL-HXF300万分之一分析天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；
KQ-500DE超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)；
UV-2100双光束紫外-可见光分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)；
UV1102酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)。
1.2试药 多花黄精(经陕西中医药大学药学院颜永刚教授鉴定为百合科植物PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根茎)；
菝葜皂苷元对照品(批号：110744-201310，中国食品药品检定研究所)；
薯蓣皂苷元对照品(批号：HR20320S1，纯度≥98%，宝鸡晨光生物有限公司)；
DPPH(美国Sigma-Aldrich公司)；
ABTS(上海麦克林生物有限公司)；
维生素C(Vc)(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；
其他试剂均为分析纯。
2.1总皂苷含量测定
2.1.1工作曲线的制备[1]精密吸取菝葜皂苷元对照溶液(每mL含0.5 mg)溶液0.20，0.40，0.60，0.80和1.00 mL，分别置具塞试管中，每个浓度平行三份，加乙醇使成1 mL，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液1.0 mL(临用前配制)，高氯酸3.0 mL，充分混匀，70℃的水浴15 min，取出冰水浴冷却30 min，加入5 mL冰醋酸，充分混匀。以相应溶剂为空白，在400～800 nm扫描，确定最大吸收波长为457 nm，在457 nm处测定吸光度。以浓度(mg·mL-1)作为横坐标，吸光度值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：A=15.6015C+0.0593(r=0.9996)，在0.01～0.05 mg·mL-1范围内线性关系良好。
2.1.2供试品溶液制备方法 将多花黄精药材在60℃鼓风干燥箱烘干，粉碎，过24目筛。取10 g的黄精药粉，精密称定，置250 mL的锥形瓶内，按照2.2项下的实验设计，超声提取(功率为500 W，频率为40 KHZ)，每个实验平行3份，过滤，即得供试品溶液。
2.1.3样品的测定 精密量取1.0 mL，置于具塞试管中，按2.1.1项下方法，从“加入5%香草醛-冰醋酸溶液1.0 mL”起进行操作，测定其吸收度，在标准曲线中计算出浓度，根据公式(1)计算总皂苷的提取率(mg·g-1)。
总皂苷的提取率=C×V/M
(1)
其中，C：根据标准曲线计算溶液中皂苷的质量浓度(mg·mL-1)；
V：样品溶液体积(mL)；
M：称取样品质量(g)。
2.2响应面实验设计
2.2.1单因素实验 称取10 g多花黄精粉末若干份，在500 W，40 KHz下超声提取，单因素考察不同浓度乙醇(40%、50%、60%、70%、80%)、乙醇倍数(8，10，15，20，25倍)、不同提取时间(50、60、70、80、90 min)对提取效率的影响。按照2.1项下方法得总皂苷提取率，结果，乙醇浓度为60%时提取率最高，超声时间在70 min后提取率趋于稳定，提取率随乙醇倍数增大而增加，在15∶1～20∶1范围内时提取率变化不明显。
2.2.2响应面设计及结果 在2.2.1项实验结果基础上，以总皂苷提取率为评价指标，将上述三个影响因素各设定为3个水平。实验的水平与因素如表1所示。通过Design-Expert 12.0软件对本实验进行设计，实验结果如表2所示。
表1 响应面设计水平与因素
表2 实验设计与结果
2.2.3回归模型的建立及显著性分析 使用Design Expert 12.0.3.0软件对表2中的数据进行多元回归拟合。A(乙醇浓度)、B(液料比)、C(提取时间)和Y(多花黄精总皂苷提取率)之间的二次多项回归方程为
Y=-53.55692+1.13214A+0.543705B+
0.492410C-0.001005AB
=+0.001925AC+0.000720BC-0.010250A2-
0.017381B2-0.004228C2
如表3所示，各因素对总皂苷提取率的影响顺序依次为提取时间，乙醇浓度和料液比。对此模型行方差分析，结果如表3所示，二项式拟合复相关系r=0.9967，响应因子与响应值之间的线性关系较为显著，说明实验结果与模型拟合性较好。整体模型的P值为0.0006<0.001，模型差异极显著，能较好对响应面值进行预测。失拟误差项P值为0.4025>0.05，失拟误差不显著，表明模型选择合适,可以使用此模型对多花黄精总皂苷提取工艺进行分析和预测。
表3 回归方程各项方差分析
2.2.4因素交互作用分析 三个因素交互作用的响应面曲面图见图1，反映出提取过程中每两个因素相互作用对提取率的影响，从而确定总皂苷提取的最佳条件。
图1 响应面曲线图
2.2.5提取条件优化及模型验证 根据回归模型预测，乙醇的浓度为61.37%、料液之比为1∶15.385(g·mL-1)、提取时间为73.520 min，总皂苷类提取率的最大预测值3.4694 mg·g-1。考虑到实际操作问题，将该工艺修改为：15倍的61%乙醇溶液超声提取74 min。按修订工艺进行三次验证实验，得多花黄精总皂苷平均提取含量为3.50 mg·g-1，与模型预测结果接近，说明该提取工艺合理可靠，重现性较好，也验证了响应面设计优化多花黄精提取工艺稳定可行。
2.3多花黄精总皂苷体外抗氧化活性研究
2.3.1多花黄精总皂苷的制备 取多花黄精粉末5 g，精密称定，按2.2.5最佳提取工艺制得提取液，浓缩后加乙醇静置10 h除去多糖，抽滤，用75%乙醇定容至100 mL，即得多花黄精总皂苷提取液，按2.1.1项下方法进行含量测定。
2.3.2黄精总皂苷对DPPH自由基的清除[13-14]精密称取7.88 mg DPPH粉末，无水乙醇溶解并定容至100 mL得0.2 mmol·L-1DPPH溶液，-4 ℃保存。将2.3.1制备的黄精总皂苷提取液用75%乙醇配制成不同浓度的样品溶液。分别精密吸取不同浓度的样品溶液100 μL，与100 μL DPPH溶液于96孔板混匀，室温下避光反应30 min，于517 nm处测定，平行操作3次。Vc为阳性对照，按公式(2)计算DPPH清除率，并通过SPSS Statistics 23处理结合Probit模型计算半数抑制浓度(IC50)，结果如图2所示。
(2)
式(2)中：A0表示不含样品的DPPH混合溶液的吸光度；
A′0为溶剂对照；
Ai表示含样品的DPPH混合溶液的吸光度值；
Aj表示样品与无水乙醇混合溶液的吸光度。
图2 黄精总皂苷与VC对DPPH的清除效果
由图2的数据可以得出，黄精总皂苷对DPPH清除率与其样品浓度呈剂量依赖性，其清除能力弱于Vc，其中，当黄精总皂苷浓度达到110 μg·mL-1时，对DPPH自由基的清除率为56.15 %，其IC50值为91.90 μg·mL-1。表明，黄精总皂苷对DPPH自由基具有一定清除效果。
2.3.3黄精总皂苷对ABTS自由基的清除[15]用纯水制得7.0 mmol·L-1ABTS溶液，2.45 mmol·L-1K2S2O8溶液，并按1∶1比例混合，避光室温保存12～16 h，制得ABTS母液。用纯水稀释母液至吸光度为0.7±0.02，得ABTS待测液。将2.3.1制备的黄精总皂苷提取液用75%乙醇配制成不同浓度的供试品溶液。将180 μL稀释的ABTS自由基溶液与20 μL供试品溶液于室温下在96孔板中避光反应10 min，于734 nm处测定其吸光度。Vc作为阳性对照，按公式(3)计算清除率。平行操作3次，结果如图3所示。
(3)
式(3)中：A0表示不含样品的ABTS混合溶液的吸光度；
A′0为溶剂对照；
Ai表示含样品的ABTS混合溶液的吸光度值；
Aj表示样品与无水乙醇混合溶液的吸光度。
图3 黄精总皂苷与VC对ABTS的清除效果
由图3可知，黄精总皂苷对ABTS的清除率与其样品浓度呈剂量依赖性，清除能力弱于Vc。其中，当黄精总皂苷浓度达到110 μg·mL-1时，对ABTS自由基的清除率达到66.87%，接近Vc，其IC50值为60.42 μg·mL-1。表明，黄精总皂苷对ABTS自由基具有一定清除能力。
本研究用紫外分光光度法对多花黄精总皂苷进行含量测定，用香草醛-冰醋酸法进行显色，对显色后的黄精样品溶液、菝葜皂苷元对照品溶液和薯蓣皂苷元对照品溶液在可见光400～800 nm扫描，比较最大吸收波长，黄精样品最大吸收波长457 nm，菝葜皂苷元最大吸收波长460 nm，薯蓣皂苷元最大吸收波长542 nm，最终确定以菝葜皂苷元作为多花黄精总皂苷含量测定的对照品，测定波长为460 nm。
目前黄精总皂苷的提取方法研究主要有回流提取法、超声波法，微波法、酶法等[16-19]。对于多花黄精总皂苷提取工艺研究报道较少，尤新军等[20]用正交设计优化多花黄精总皂苷提取条件，结果表明超声法提取法最佳，具有高效、安全、成本低等优点。本研究采用响应面法优化超声提取多花黄精总皂苷的条件，以总皂苷含量为评价指标，考核不同浓度乙醇、液料比、提取时间对提取效率的影响。多花黄精中的多糖和总黄酮抗氧化活性研究较多，对具有多种活性的甾体皂苷类成分抗氧化活性方面的研究，笔者未见报道。本研究并对黄精总皂苷初步纯化后，考察其对ABTS自由基阳离子和DPPH自由基的清除效果，结果表现出较好体外抗氧化活性。本研究为多花黄精总皂苷的提取及开发利用提供参考。
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