王林华，欧阳乐飞，高威，段健诚，张庆起，高焕,2,3
（1.江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005；
2.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222001；
3.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014；
4.连云港赣榆佳信水产开发有限公司，江苏 连云港 222100）
汞的毒性极强，已被我国和世界卫生组织等诸多国家和机构列为优先控制污染物[1,2]。人类活动过程中向大自然排放了大量的重金属汞及其化合物[3]。汞在自然界中主要以单质汞、有机汞化合物和无机汞化合物三种形态存在，形态不同，毒性也不同[4]。自然界中无机汞较少，毒性相对较小，但长期暴露在其中会引起慢性中毒[4]。目前有关汞对水产动物的毒性研究主要集中于汞对水产动物酶活性的影响及其机制[5]。研究表明，汞能与大西洋鲑（Salmo salar）等水产动物体内的谷胱甘肽过氧化物酶等相结合，降低其清除自由基的能力，使体内的脂质过氧化物含量升高，导致细胞死亡[6,7]。汞还能显著影响抗氧化物酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶等酶的活性[8,9]和金属硫蛋白[10]等蛋白的结构和表达。Li 等[11]研究了低温下汞胁迫下草鱼抗氧化防御系统和基因表达情况。这些研究主要从生理响应角度展开，但对机体的物理结构损伤还鲜见报道。
脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）是我国特有经济虾之一，以黄渤海产量最高。脊尾白虾由于具有繁殖力强、生长快、味道鲜美和环境适应性广等特点，已成为我国沿海地区重要的混养种类之一，其产量仅次于中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）和中国毛虾（Acetes chinensis）[12-14]。目前关于脊尾白虾的研究主要集中在养殖技术[15]和生物学特性[16]等方面，汞对脊尾白虾影响的研究还较少，关于汞对脊尾白虾的肌肉组织结构影响的研究还未见报道。近年来，随着工业的发展，水域环境受污染日益严峻，严重威胁水产品质量安全[17]。养殖水体中重金属污染严重影响养殖对象的生理机能和组织形态，且生物长期暴露在低浓度污染的水体中，会引起多种组织病理学变化，根据生物体的组织结构病理变化来监测养殖水体的污染程度及危害程度[18]。而肌肉组织细胞是维持肌肉组织正常功能的基本单位，一旦肌肉组织无法正常工作，会影响动物取食和避敌能力，影响其生存能力[19]。脊尾白虾可食用部分主要是肌肉，而肌肉质量占全虾质量最多，其所含有害金属含量百分比较高[20]。肌肉组织中的酶活力变化可以反映肌肉损伤程度[21]。本文通过检测超氧化物歧化酶（SOD）活力，用石蜡切片和H.E.染色的方法观察了不同浓度汞胁迫下脊尾白虾肌纤维的变化特征，以期为揭示重金属对甲壳类的毒害作用及其机制提供帮助。
1.1 材料
实验用脊尾白虾平均体长（4.5±0.5）cm，平均体质量（1.5±0.5）g，来自江苏省连云港市本地养殖场，经两周实验室暂养。暂养期间盐度26，水温（25±1）℃，pH8.2～8.3，溶解氧在5 mg/L 以上，每天早上8 点和晚上6 点投喂饵料，自然光照。将体质健壮、体色正常、规格一致的健康脊尾白虾随机分组进行胁迫实验。实验前24 h 停止投喂。
1.2 方法
根据参考文献[22]，实验设3 个汞离子浓度梯度：0 g/L（对照组）、1×10-6g/L，3×10-6g/L 和1×10-5g/L，汞（Hg2+）溶液由氯化汞（HgCl2）配置。每组设三个重复，每个重复放22 尾虾。实验期间不间断充氧，溶解氧在5 mg/L 以上，盐度26，水温（25±1）℃，实验容器为60 L（50 cm×40 cm×30 cm）的蓝色水箱。自然光照，早8 点和晚6 点清理粪便和死虾。实验期间不换水，不投喂，分别在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 记录各组试验虾的中毒症状及死亡情况，每个时间点每组取3 尾虾，取0.2 g 肌肉组织先用液氮速冻，再放入-80℃保存，用于测定SOD活性；
另取0.5 cm3肌肉组织用Bouin’s 固定液固定，用于组织切片。
1.2.1 脊尾白虾肌肉组织中SOD 活力的测定
取0.2 g 肌肉组织加入1.8 mL 的生理盐水，冰浴下匀浆，2 500 r/min 离心10 min，取上清液用生理盐水按照1∶4 稀释成2%的组织匀浆，待测。根据南京建成生物工程研究所SOD 试剂盒采用羟胺法测定SOD 活性，即每mg 组织蛋白在1 mL 反应液中SOD 抑制率达50%时所对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U/mg）。
1.2.2 脊尾白虾肌肉组织切片
迅速取出肌肉组织放入Bouin’s 固定液中固定24 h，乙醇梯度脱水，用二甲苯透明，石蜡包埋，KD-1508A 轮转式切片机连续切片，切片厚度为6 μm，苏木素-伊红染色，Nikon 90i（日本）全自动电动显微镜观察拍照。
1.3 数据分析
实验数据用mean±SD 表示，用统计分析软件SPSS 18.0 进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比较（LSD 法），差异显著水平设为P<0.05。数据结果用Origin 2018 进行绘图。
2.1 不同浓度汞胁迫对脊尾白虾肌纤维结构的影响
不同浓度的汞胁迫后，脊尾白虾的肌纤维变化如图1 所示。对照组脊尾白虾（图1-a）肌纤维在不同区域聚集成束状，排列紧密。在浓度为1×10-6g/L、3×10-6g/L 和1×10-5g/L Hg2+的胁迫下，脊尾白虾肌纤维结构在6 h、12 h、24 h 和48 h 变化不明显。汞胁迫72 h 后，养殖水体中Hg2+的浓度为1×10-6g/L 时，脊尾白虾的肌纤维变化不明显（图1，72-2）；
而Hg2+的浓度为3×10-6g/L 时，脊尾白虾肌纤维有溶解的现象（图1，72-3）；
Hg2+的浓度为1×10-5g/L时，脊尾白虾肌纤维比3×10-6g/L 时溶解的区域更多（图1，72-4）。脊尾白虾经过Hg2+胁迫96 h 后，Hg2+的浓度为1×10-6g/L 时，脊尾白虾的肌纤维有溶解现象（图1，96-2）；
Hg2+的浓度为3×10-6g/L时，脊尾白虾肌纤维比1×10-6g/L 溶解的区域更多（图1，96-3）；
当Hg2+的浓度增加到1×10-5g/L 时，脊尾白虾肌纤维有部分断裂（图1，96-4）。
2.2 不同浓度汞胁迫脊尾白虾SOD 活力的变化特征
不同浓度汞胁迫下，脊尾白虾SOD 活力的变化特征如图2 所示。不同浓度Hg2+胁迫后，随时间的变化，脊尾白虾肌肉组织中的SOD 活力先下降后上升，24 h 时达到最低值，各浓度汞胁迫组（1×10-6g/L、3×10-6g/L 和1×10-5g/L）的最低值分别为6.65 U/mg、6.42 U/mg 和6.89 U/mg。本研究表明，与空白对照组相比，在72 h 之前，各Hg2+浓度胁迫组的脊尾白虾肌肉组织中SOD 活力显著下降（P<0.05），而在72～96 h 时，各Hg2+浓度胁迫组的SOD 活力明显上升。Hg2+的浓度为1×10-6g/L 时，在96 h 时SOD活力达到最高，为24.639 U/mg，而Hg2+的浓度为3×10-6g/L 和1×10-5g/L 时，在72 h 时SOD 活力达最高，分别为21.744 U/mg 和25.780 U/mg。与对照组相比，在6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 时，胁迫组（1×10-6g/L、3×10-6g/L 和1×10-5g/L）与对照组差异显著（P<0.05）。
3.1 重金属对水生动物机体物理损伤的影响
重金属主要是通过水生动物的呼吸、吞食和皮肤进入体内，通过一系列化学反应将重金属转变成水溶性高且易于排出体外的化合物[23]。但是，有研究表明，水生动物中肌肉组织中的重金属比鳃、胃肠和肝脏更难排出体外[24]，而更容易积累在肌肉组织中。肌原纤维会随重金属处理时间的延长出现断裂[25,26]。脊尾白虾肌肉组织不仅给人类提供营养物质，同时也承担着运动功能。因此，脊尾白虾的肌肉损伤影响了食品的品质和安全，也降低其运动功能和免疫功能[27]。Lourduraj 等[28]研究发现，重金属可使蟹的肌肉等组织畸形，随重金属浓度升高，损害程度加强。背角无齿蚌（Anodonta woodiana）经过Cu2+胁迫后，肾脏组织出现腺上皮细胞分布散乱，甚至破碎等现象[29]。随着铜镉的浓度增加，鲫（Carassius auratus）的肌纤维溶解和断裂，严重损伤肌肉组织[27]。这与本实验结果一致，可能是随着汞对脊尾白虾胁迫时间的增加，汞在脊尾白虾体机体内的浓度升高，肌纤维受损，导致肌纤维受损，出现溶解和断裂现象。而李涛[21]研究结果表明，鲫受重金属污染，脾脏组织结构发生改变，而肌肉组织没有病理学特征。这与本实验结果有所不同，这可能与物种差异和养殖环境的影响有关。
本研究中，在72 h 和96 h 时，各个组均与48 h及以前的肌肉结构有一定差异，这可能是汞对脊尾白虾肌肉组织的损伤不仅存在剂量效应，还存在时间效应，即随着汞浓度的增加和胁迫时间的延长，肌肉组织的损伤程度均明显加重，这与王兰[25]和涂叶绿[27]等的研究结果一致。
3.2 不同浓度汞胁迫脊尾白虾SOD 活力的变化特征
氧通过还原反应生成一些活性氧（ROS）代谢物，如超氧阴离子自由基（O2-）和羟自由基（HO-）等[30]。一般情况下，机体代谢需要少量ROS 来参与，但是也存在清除ROS 的过程，因此生物体内ROS 含量在一定范围内保持动态平衡[30,31]。当生物体受到环境胁迫时，机体ROS 产生过多，超过机体本身的清除能力，导致机体受损。水产动物在进化过程中形成了有效的抗活性氧系统[32,33]，包括酶和非酶系统，酶系统包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等[34]。汞可以通过抑制水产动物的抗氧化酶活性来影响其防御机制[5]，而SOD 是抗活性氧的第一道防线，广泛存在于生物体当中[35,36]。SOD 通过将O2-歧化成O2和H2O2来清除超氧阴离子，保持ROS 系统的平衡，这对机体预防损伤和抗氧化有重要作用[30,37,38]。脊尾白虾受到汞胁迫时，体内会产生相应的酶来抵抗体内的重金属离子，其中SOD 能歧化超氧阴离子自由基产生H2O2，清除机体有害自由基[39]。Morcillo 等[40]研究发现，汞等重金属会导致硬骨鱼细胞产生过量的活性氧，导致抗氧化酶系统失去平衡，引起细胞凋亡。
管越强等[41]研究表明，肌肉SOD 活力随低氧胁迫时间延长先降低后升高，在8 h 达到最低，9.5 h之后有所上升，这与本实验SOD 活力变化相似。而呼光富等[31]研究表明，随着镉胁迫时间延长，肝胰腺和触角腺的SOD 活力先上升后下降，48 h 时达到最高，在72 h 时最低，但是仍然高于对照组。这与本试验的研究结果有所不同，这可能是汞胁迫使脊尾白虾体产生大量O2-被超氧化物歧化酶还原成H2O2，O2-的减少和H2O2的大量产生，导致SOD 活性下降[31]。SOD 活性随着汞胁迫时间的延长而有上升趋势，可能是在过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，H2O2被分解成O2和H2O，抑制解除，使得脊尾白虾机体内的ROS 处于动态的平衡之中[37]，SOD 活力的变化反应机体清除O2-能力。
不同浓度的汞胁迫对脊尾白虾SOD 活力和肌肉组织有毒性作用，并存在一定的“时间-效应”关系。SOD 活性间接反应了机体清除自由基的能力；
随着胁迫时间延长，脊尾白虾机体内汞的浓度升高，肌纤维开始溶解和断裂。上述结果表明，在水产养殖中，尤其是汞排放量较高的区域，需要特别关注汞胁迫对脊尾白虾的生长和食用安全性的不利影响。