李青芝，陈叶雨，吴晓雲，刘 亚，赖见生，李 华，杨焕超，宋明江，龚 全，林 珏
(四川省农业科学院水产研究所，成都 611731)
【研究意义】糖皮质激素(Glucocorticoids, GCs)参与脊椎动物的许多生理过程，尤其在应激反应中发挥着重要的作用，其功能在脊椎动物的进化过程中非常保守[1-2]。在硬骨鱼中，皮质醇被认为是应激刺激时产生的主要糖皮质激素[3]。皮质醇通过与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptors, GR)结合作用于细胞，GC/GR系统通过调节代谢、心血管和免疫功能来介导应激反应[4-5]。GR属于核受体超家族，在哺乳动物中，GR包含GRα和GRβ两种亚型。GC主要和GRα结合发挥其生理作用，而GRβ竞争性负调节GRα的功能[6]。目前为止，鱼类中GR相关研究非常有限，2003年在两种硬骨鱼虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[7]和伯氏朴丽(Haplochromisburtoni)[8]中发现了编码GR的基因序列。此后，一些硬骨鱼中也被发现存在有两种不同的GR基因[9-10]，而在斑马鱼中只鉴定出一种GR基因[11]。目前关于硬骨鱼中两类GR的功能研究还处于起步阶段。水产养殖过程中，鱼类经常会受到病原微生物及其它不良环境因子造成的应激干扰。应激反应将激活下丘脑—垂体—肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-interrenal axis, HPI)，导致鱼类机体快速释放促肾上腺皮质激素(ACTH)进入血液和分泌糖皮质激素皮质醇[12-13]。由于血浆皮质醇含量的持续升高对鱼类的生长、繁殖与免疫机能等多方面有重要影响，因此涉及皮质醇合成调控的HPI轴在应激相关研究中备受关注[14]。释放到循环系统的皮质醇通过被动扩散进入细胞或通过载体介导的过程进入细胞[15]，在细胞内，它与GR结合，作为配体依赖的转录因子控制和调节基因表达[16]。受体数量或亲和力可能直接影响靶细胞的反应程度[17]。【前人研究进展】目前，关于鱼类中环境因子应激对GR表达量影响的相关研究还十分有限。在低水位急性应激作用下，斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)肝脏中GR基因的表达了会发生显著性变化；
腹腔注射皮质醇会引起团头鲂不同组织中GR表达水平的变化[3]；
随着养殖密度的变化，欧洲鲈鱼(DicentrarchuslabraxL.)肝脏中的GR表达量会显著变化，高密度养殖会显著抑制GR基因的表达，说明养殖密度也是调节GR表达的应激因子之一[18]。大鼠在饥饿胁迫作用后，胃部的GR在转录和蛋白水平上都发生了显著性上升[19]，而饥饿应激对鱼类GR基因表达量影响的相关研究目前还几乎处于空白阶段。【本研究切入点】长江鲟(Acipenserdabriyanus)又称达氏鲟，是我国长江上游的特有物种[20]。近年来，由于人类活动的影响，长江鲟的自然种群数量急剧下降。到目前为止，长江鲟野生种群基本绝迹，被国际自然保护联盟(IUCN, www.iucnredlist.org/details/231/0)列为极度濒危物种，并被列为中国一级保护动物。因此，目前对长江鲟进行有效的人工养殖是维持其种群数量的关键。然而，在长江鲟养殖过程中，常常会受到各种环境因子造成的应激干扰，从而影响其成活率。【拟解决的关键问题】本研究以长江鲟为研究对象，首次报道糖皮质激素受体GR的cDNA序列，并对其结构进行了分析，检测了组织表达的特征和饥饿胁迫作用下的表达模式，将为进一步研究长江鲟应激反应过程中GR的功能奠定基础。
1.1 实验材料
本研究使用的长江鲟为四川省农业科学院水产研究所F2代幼鱼。在实验前，实验鱼在工厂化循环水养殖系统中暂养两周，以适应实验条件。饲喂蛋白质41.31%、脂肪10%、水分9.14%、灰分13.51%的商品饲料。
1.2 基因序列及生物信息学分析
GR基因的全长序列来源于长江鲟SMRT全长转录组测序[21]。cDNA序列开放阅读框ORF分析用Vector NTI 10.3.0进行。从NCBI主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载其他脊椎动物GR基因的氨基酸序列，利用ClustalX和DNAMAN对GR基因与其它鱼类同源氨基酸序列开展多重比对。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线预测蛋白质结构域特征。采用phyre2软件预测蛋白三维结构。利用MEGA 6.0的Neighbor-joining方法构建系统进化树。
1.3 RNA提取及组织表达分析
选取5尾健康的长江鲟，采集皮肤、眼、脑、鳃、肝、脾、胃、心、肠和肌肉10个组织进行组织表达分析。实验鱼解剖前用MS-222处理，分离组织后速冻于液氮，随后转移至-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA。用TRIzol法提取总RNA，RNA质量用琼脂糖凝胶电泳进行初检，随后利用超微量分光光度计检测RNA的纯度和浓度。第一链cDNA使用ReverTra Ace-First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒获得，-20 ℃保存备用。
1.4 饥饿复投喂下GR基因的表达量检测
饥饿复投喂实验共设4个组，每组设置3个重复，每个重复为10尾长江鲟，共120尾长江鲟。初始体重为(60.53±0.28) g(平均±标准误，下同)，初始体长为(19.96±0.28) cm。经过两周暂养后，鱼被随机分为4个组别：禁食0 d和复投喂14 d (0 d，对照组)；
禁食3、7和14 d，复投喂14 d(3、7 和14 d)。在禁食结束后和复投喂14 d时，采集肝脏和肠道组织，随即在液氮中冷冻，然后转移到-80 ℃冰箱中保存备用。
1.5 实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR检测通过Bio-Rad CFX Con nect System (Bio-Rad, 美国)进行。PCR反应条件如下：98 ℃ 3 min；
98 ℃ 5 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，循环反应40次；
最后，70～95 ℃获取熔解曲线。PCR反应体系为10 μL，包括5 μL TB Green Premix ExTaqTMII (Takara, 日本)，2 μL 20倍稀释后的cDNA模板，各0.5 μL的上下游特异性引物(表1)和2 μL PCR级灭菌水。内参基因选取β-Actin，采用2-ΔΔCt法计算样品中GR基因mRNA的相对表达量。
表1 本研究使用引物
1.6 数据分析
饥饿复投喂实验中，GR基因在各组之间的差异表达，使用SPSS 19.0软件进行显著性分析。基于单因素方差分析基础上，采用Turkey多重比较法对组间差异进行检验，P<0.05时为显著差异。
2.1 长江鲟GR序列及系统进化分析
长江鲟GR基因开放阅读框为2316 bp，编码771个氨基酸，其分子量为84.97 kDa，等电点为5.70。通过蛋白质结构域的功能分析，发现此编码蛋白在403～483位置存在保守的锌指结构域，在559～723位置存在一个激素受体配体结合域HOLI(图1-A)。根据phyre2软件预测结果，GR的三维结构由α-螺旋和无规则卷曲构成(图1-B)。
将长江鲟和其他物种的GR氨基酸序列进行比对(图2)，序列相似性依次如下：小体鲟(Acipenserruthenus, 98.6%)、匙吻鲟(Polyodonspathula, 92.4%)、斑点雀鳝(Lepisosteusoculatus, 73.0%)、热带雀鳝 (Atractosteustropicus, 72.1%)和大海鲢(Megalopscyprinoides, 68.0%)。
采用MEGA 6绘制系统进化树，结果显示，长江鲟的GR均可与其他物种的GR聚类，其中，长江鲟的GR与小体鲟同源性较高，紧密聚在一起，置信度为100%，且与匙吻鲟GR聚为一分支，随后与其余鱼类GR聚为一个大的分支，而哺乳动物人和小鼠的GR则聚为另一个单独的分支(图3)。
2.2 不同组织中GR的表达水平
GR在长江鲟的皮肤、眼、脑、鳃、肝、脾、胃、心、肠和肌肉共10个组织中都有表达(图4)，但是表达水平不同。其中，脾脏中GR表达量为最高，其次为鳃、肝脏、心脏和脑，其余组织中表达量相对较低。
2.3 饥饿胁迫下长江鲟GR表达量的变化
长江鲟各组织中GRmRNA表达量在饥饿期间出现不同的变化(图5)。饥饿3 d后，肠道中GR表达量无显著性变化。在饥饿第7天表达量出现峰值，显著高于第0天(P<0.05)，饥饿第14天后无显著性变化。肝脏中GR相对表达量随饥饿时间的增加而逐渐上升，在饥饿7和14 d后，其表达量均显著高于对照组。复投喂后，肠道和肝脏中GR在各处理中的表达量与对照组相比均无显著性变化(图6)。
3.1 长江鲟GR氨基酸序列特征及进化分析
长江鲟的GR序列与其他硬骨鱼的GR序列具有共同特征和高度相似性，包含有保守的锌指结构域和激素受体配体结合域，与斑点叉尾鮰[3]和虹鳟[22]
相似。GR在硬骨鱼中相对保守的氨基酸结构表明其在鱼类中具有相似的生理功能。硬骨鱼GR氨基酸序列中，存在一个独有的9-aa插入序列(WRARQNTDG)，位于锌指结构域之间[23]。迄今为止报道的大多数硬骨鱼GR中，都有WRARQNTDG氨基酸插入序列。在绿河鲀(Tetraodonnigroviridis)[10]和鲤鱼(Cyprinuscarpio)[24]中发现了两个例外，其插入序列分别为WRARQNTVC和WRARQNADG。最近，对进化上处于原始地位的硬骨鱼GR的研究还发现了另外两个插入序列，即小体鲟(Acipenserruthenus)的WRARQNMDG序列和非洲蝴蝶鱼(Pantodonbuchholzi)的WRARQTSEG序列[9]。本研究中，该特殊的9-aa插入序列为WRARQNMDG，与小体鲟一致，这些研究结果表明，插入序列尤其前7个氨基酸在鱼类进化中非常保守，但这些保守氨基酸的功能意义目前尚不清楚。进化树分析发现，所有鱼类不同物种的GR形成了一个大的分支，表明鱼类糖皮质激素受体的形成来自于同一祖先，而长江鲟及其余鲟鱼的GR位于进化树硬骨鱼分支中相对根部的位置，说明鲟鱼在进化上处于较于原始的地位。
3.2 长江鲟GR基因组织分布特征
健康长江鲟所有检测组织中均有GR基因表达，各组织之间的表达水平不同，暗示了其广泛参与机体功能活动的生物学意义。在本研究中，长江鲟GR高表达于免疫器官脾脏、肝脏和鳃，该结果与团头鲂[14]和斑点叉尾鮰[3]的研究类似。本研究中，长江鲟GR在渗透调节、应激、免疫调节和代谢的相关组织中存在差异表达。Stolte等[24]对鲤鱼的研究中发现，LPS注射后，GR表达量会出现显著性下降；
同时，寄生虫侵染鲤鱼后，会引起脾脏中的GR表达量显著上调，证明GR参与到了鲤鱼免疫调节的生物学过程中。本研究中，脾脏中GR的高表达暗示着长江鲟GR可能也具有免疫调节相关功能。肝脏是鱼类重要的代谢器官及应激反应后的主要应答器官。研究表明肝脏中GR的表达量会随环境胁迫因子(例如低水位急性应激和养殖密度等)的变化而出现显著变化[3, 18]。GR在肝脏中的高表达提示着长江鲟GR与肝脏抗应激反应的密切关系。鳃具有排泄氮代谢废物和参与渗透压调节的重要功能，同时，鳃是鱼类的一种粘膜免疫器官，对病原微生物的入侵起到了第一防线的作用。在斑马鱼的研究中，Kumai等[25]发现GR参与了鳃的渗透压调节活动。GR在长江鲟鳃中的高表达提示其可作用于渗透调节功能。除免疫器官外，常波等[26]对大鼠的研究结果显示，GR在大脑的海马区高度表达，与其参与HPA (Hypothalamic-pituitary-adrenalaxis)功能调节密切相关。应激反应会激活机体HPI轴，导致糖皮质激素皮质醇的分泌，GR参与到该生物学过程中，并调节基因表达[16]。HPI轴和HPA轴作为同源结构，基于脊椎动物进化的保守性，长江鲟GR在大脑中的高表达意味着其相似的调节功能。
3.3 长江鲟GR在应激环境下的表达特征分析
类固醇激素在鱼类中具有重要作用，相关激素受体系统在急剧变化的应激条件下，起到调节代谢功能以及盐和水平衡的作用[22]。在水产养殖中，了解应激水平是实现和维持良好鱼类养殖和福利标准的关键参数。为了评估鱼在环境应激条件下的暴露情况，需要检测一系列生物标志物，包括对内分泌参数的评估。糖皮质激素及其受体在许多生理过程中具有调节作用，包括碳水化合物代谢、骨代谢、发育、细胞周期、免疫功能、应激反应、中枢神经功能、生长和生殖[1-2]。糖皮质激素对正常发育和维持基础和应激相关的内环境平衡至关重要。糖皮质激素的所有生物学功能都是由糖皮质激素受体介导[23]。在鱼类中，GR也被证实参与到了多种抗应激反应过程中[3, 18, 24]。
在水产养殖中，饥饿不仅会导致鱼类生长停止，而且会对鱼类造成应激反应。研究表明饥饿胁迫条件下，长江鲟细胞的保护机制被激活，热休克蛋白HSP70-4基因表达量表现出显著上调，以对抗应激反应对机体造成的损伤[27]。而饥饿胁迫对应激相关基因GR在肝脏和肠道转录水平上表达量的影响，目前还没有相关研究。本研究发现，GR基因的表达量在饥饿期间发生了改变，长江鲟肠道和肝脏中GRmRNA显著上调表达，表明GR在维持因饥饿引起的应激中起到了一定稳态作用。在饥饿14 d后，肝脏中GR基因仍出现显著上调表达(P<0.01)，表明在相对长时间的饥饿胁迫后，GR仍处于较高表达水平，并在此期间具有保护作用。而在复投喂过程中，与对照组相比，各组别的GR相对表达量没有显著变化，表明补充食物后，GR的表达量恢复到了正常水平，机体的应激反应得到了缓解。禁食是一种应激状态，会导致血液中糖皮质激素浓度高[28]。在鱼类中，饥饿胁迫对肝脏和肠道GR转录水平上表达量的影响鲜有报道。在大鼠中，禁食可引起血浆皮质酮浓度升高，并引起胃部GR在转录和蛋白质水平上的表达量增高[19]；
在北极红点鲑(Arcticcharr)中，禁食会提高血浆皮质醇水平和大脑中的GR含量，这种升高可能在北极红点鲑适应长时间禁食的过程中发挥着重要的作用[29]。本研究结果表明长江鲟GR参与了饥饿胁迫对机体造成的应激反应，并在此期间具有保护作用。
本研究从长江鲟中鉴定了GR基因，序列比对和系统进化分析表明该基因与鱼类糖皮质激素受体高度相似，具有其家族保守的结构域；
长江鲟GR广泛分布于不同组织中，对饥饿胁迫有明显的应答响应，该研究结果不仅有助于对鱼类GR生物学功能的进一步认识，也可为今后长江鲟对抗应激反应的研究提供理论依据。