李洋，田淑芬*，王超霞，苏宏，李凯，黄丽秋
（1. 天津农学院园艺园林学院，天津 300380；
2. 天津农业科学院果树研究所，天津 300380）
‘玫瑰香’是我国的主栽葡萄品种之一。该品种香气浓郁、口味独特，既可以鲜食、制汁，也是制作葡萄酒的良好原料[1]，用汉沽产的‘玫瑰香’葡萄酿制的白葡萄酒多次获得国际金奖[2]。葡萄果实品质的衡量指标有很多，其中香气是非常重要的指标之一。葡萄香气是一个相对复杂的性状，由多种挥发性化合物构成[3]，主要包括醛类、醇类、酯类、酮类和萜烯类等[4-5]。
葡萄果实挥发性香气化合物的合成途径主要有三种：萜类代谢、脂肪酸代谢和氨基酸代谢途径[6-7]。里哪醇合成酶基因（Linalool synthetase,LIS）、异戊烯基焦磷酸还原酶基因（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase,HDR）、类胡萝卜素裂解双加氧酶基因（Carotenoid cleavage dioxygenase,CCD）、9-顺式环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶基因（9-cis epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）都是萜类代谢合成途径中的基因，LIS是萜类物质合成后期的关键基因，催化里哪醇的合成。HDR是2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）上游途径的限速酶，与植物类胡萝卜素代谢关系密切且正相关。CCD和NCED可将类胡萝卜素分解生成下游产物，形成降异戊二烯类物质或脱落酸（ABA），其中CCD1的表达调控与β-紫罗酮的合成有关。脂肪酸代谢途径包括脂氧合酶途径和β-氧化途径，脂氧合酶基因（lipoxygenase,LOX）、脂氢过氧化物裂解酶基因（hydroperoxide lyase,HPL）和乙醇脱氢酶基因（alcohol dehydrogenase class,ADH）都是脂氧合酶途径中的相关基因。LOX使不饱和脂肪酸生成氢过氧化物，再经过氢过氧化物裂解酶HPL生成醛类物质（己醛或己烯醛），后在醇脱氢酶的作用下生成醇。VvLOXA与己烯醛的形成有关，主要在果皮中表达，尤其在转色期大量表达，而VvADH3与反-2-己烯醛有明显的正相关性[8-10]。
成熟葡萄中的香气成分受多种因素的影响，包括品种、生长环境条件、栽培管理和收获时间[11-14]。在许多情况下，这些变量会通过改变相关香气生物合成途径中基因的表达量，而改变代谢产物的量与组成[15]。在栽培管理中，修剪方式对调节葡萄生长起着很重要的作用，通过以源库单位的可变性为理论基础，调节光合产物在不同器官之间的分配与运输，使得树体的生殖生长和营养生长达到平衡[15-17]。通过修剪改变叶果比，在一定程度上可以影响果实的品质与香气[18]。有研究表明，提高叶果比可显著降低果实中苹果酸、酒石酸质量比，显著提高可溶性糖、花色苷、总酚含量以达到提高葡萄果实口感和香气品质的目的[19-21]。因此，研究不同叶果比对葡萄果实香气的影响具有重要经济价值。
本试验选取‘玫瑰香’葡萄为试材，通过修剪成不同叶果比的方式，研究其对果实成熟前后可挥发性香气成分的变化及与香气形成相关基因的表达，探索‘玫瑰香’葡萄适宜的栽培管理技术，为农业栽培提供理论依据。
1.1 试验材料
试验于2019年4月16日至8月14日在天津农科院武清现代农业科技创新基地进行。供试品种为7年生‘玫瑰香’葡萄，日光温室种植，株行距为1.0 m×2.0 m，独龙干双臂“V”形叶幕，结果新梢间距为15 cm，每个新梢留1果穗。
1.2 试验设计
试验设置2个不同的叶果比处理，分别是8∶1（A处理）和16∶1（B处理），每个处理15株树。A处理修剪方式：4叶（果穗以下4叶，副梢全部抹除）＋2叶（果穗以上2叶，副梢全部抹除）＋2叶（摘心后保留2叶，副梢全部抹除）；
B处理修剪方式：4叶（果穗以下4叶，副梢全部抹除）＋8叶（果穗以上4叶，每节保留副梢1叶）＋4叶（摘心后保留2叶，每节保留副梢1叶）。在坐果后进行定期修剪，以保持试验过程中叶果比不变，其他管理同常规。
取样时期：分别在5月30号（转色期）、6月26号（始熟期）和7月22号（成熟期）采集果穗上、中、下三个部位果实样品，保存在-80 ℃冰箱，用于可挥发香气成分和基因相对表达量的检测。
1.3 测定指标与方法
1.3.1 果实香气成分的测定
所有样品于2019年11月8日解冻后匀浆，采用美国安捷伦7890B-5977A气相色谱-质谱仪（GC-MS）进行香气分析。
色谱条件：载气（高纯He）：纯度≥99. 99%，流速1.0 mL·min-1，分流比5∶1；
升温程序：35 ℃保持2 min，以4 ℃·min-1升至200 ℃，然后以30 ℃·min-1升至250℃，保持5 min；
进样口温度：250 ℃。
质谱检测条件：离子源温度：230 ℃；
传输线温度：250 ℃；
电子轰击源：70 eV；
扫描范围：30～300 amu。
利用顶空固相微萃取-气质联用（HS-SPME-GCMS）分析方法。对检测的挥发性成分通过未知物分析软件与NIST 11.L谱库（均为美国Agilent公司）提供的标准谱图进行匹配，如果匹配因子大于80（最高100），通过相同GC-MS条件下标准品的保留时间和质谱图进一步比对确认。
定量分析：称取2.4 g NaCl于20 mL顶空瓶中，加入匀浆样品8 mL，并加入内标物2-辛醇8 μL（180 mg·L-1，无水乙醇稀释），顶空瓶加盖密封后待测。CTC固相微萃取条件：45 ℃预热5 min，磁力搅拌子转速为250 r·min-1（搅拌间歇式运行，转5 s，停2 s)，45 ℃萃取50 min，然后GC进样，250 ℃解吸2 min，采集数据。目标化合物采用内标-标准曲线法定量，标准曲线由5点绘制，由化学工作站计算定量结果。
1.3.2 相关基因的测定
所有样品在液氮环境中进行研磨成粉末状，使用RNA试剂盒提取葡萄果实的总RNA，以总RNA为模板利用TakaraPrimeScript TMRT-PCR试剂盒反转录合成cDNA。以EF-1α为内参基因进行荧光定量PCR，选取香气合成过程中的关键酶基因，引物参照Martin等[22]的方法。荧光定量扩增体系10 μL：2×SuperReal PreMix Plus 5 μL、上下游引物混合物（10 mmol）0.3 μL、cDNA模板0.4 μL和RNase-free水4.3 μL。
反应条件：95 ℃ 15 min；
然后95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；
最后进行溶解曲线测定。荧光定量结果通过相对定量法（2-△△t）进行分析，每次试验重复3次。
检测的基因包括：异戊烯基焦磷酸还原酶基因（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase,HDR）、里哪醇合成酶基因（Linalool synthetase,LIS）、类胡萝卜素裂解双加氧酶基因（Carotenoid cleavage dioxygenase 1,CCD1）、9-顺式环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶基因（9-cis epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）、脂氧合酶基因（lipoxygenase,LOXA）、脂氢过氧化物裂解酶基因（hydroperoxide lyase 1,HPL1）和乙醇脱氢酶基因（alcohol dehydrogenase class III,ADH3）。
1.4 数据分析
采用IBM SPSS 25和Excel进行数据分析及图表制作。
2.1 不同时期的香气成分与含量差异
果实样品中均检测出41种香气物质，按照化合物结构分别为萜烯类6种、醇类9种、醛类8种、酯类11种、酮类4种和烯类3种。由表1可知，‘玫瑰香’葡萄果实香气中醛类、醇类、萜烯类物质含量较高，而烯类物质的含量最少。在整个果实发育期，始熟期A处理中果实香气物质含量最高，为3907.72 μg·L-1，同时期醛类、醇类和烯类物质含量也达到较高水平，而此时期B处理的果实香气物质含量比A处理低563.09 μg·L-1。B处理在转色期和成熟期的果实香气物质含量分别比A处理高342.24 μg·L-1和432.62 μg·L-1。萜烯类物质作为‘玫瑰香’葡萄特征香气的主要成分，在始熟期B处理下含量最高，为870.21 μg·L-1。除此之外，3个处理时期中B处理的萜烯类物质含量均比A处理高，尤其是始熟期和成熟期B处理下萜烯类物质的含量比A处理分别高239.39 μg·L-1和126.27 μg·L-1。而醇类、酮类、醛类、烯类物质在始熟期B处理下都比A处理的含量低。总的来说，随着‘玫瑰香’果实的逐渐成熟，香气物质的含量先增加后减少，各个成分也随之发生变化。
表1 玫瑰香果实香气物质含量Table 1 Contents of aroma substances in Muscat Hamburg grapeµg·L-1
从图1中看出，对于同一处理，从转色期到成熟期，醛类占比变化不大，维持在50%，醇类物质占比从30%下降到20%左右，萜烯类物质占比从10%升高到30%左右。以A处理为对照，在转色期和成熟期，B处理对‘玫瑰香’葡萄香气物质占比影响不大。在始熟期，B处理中的果实醇类物质占比低于A处理，而萜烯类物质占比高于A处理。以上结果表明，在转色期和成熟期，叶果比对‘玫瑰香’葡萄果实香气物质占比影响不大；
而在始熟期，高叶果比能减少果实香气中醇类物质的占比，增加萜烯类物质的占比。
2.1.1 醛类香气成分的分析
由图1可知，醛类物质是所有香气成分中占比最高的，为43.91%～62.21%。从图2可以看出，醛类物质在始熟期含量最高，随着果实成熟逐渐降低。其中反式-2-己烯醛含量最高（77.63%～84.06%），其次是正己醛（13.18%～19.57%）。在转色期和成熟期，B处理果实中反式-2-己烯醛含量高于A处理，分别增加了212.46 μg·L-1和108.60 μg·L-1；
在始熟期，B处理果实中反式-2-己烯醛含量比A处理低151.27 μg·L-1；
而在整个生长过程中，A处理和B处理果实中正己醛含量变化不大（图2）。结果表明，高叶果比能增加果实中反式-2-己烯醛含量，对果实中正己醛含量的影响不大。总之，在果实发育过程中，高叶果比增加了‘玫瑰香’葡萄果实香气中醛类含量。
2.1.2 醇类香气成分的分析
醇类香气物质是所有香气类型中总量占比第二的香气物质，醇类物质的含量和占比最高的为始熟期A处理（分别为1376.50 μg·L-1和35.23%），最低的为成熟期A处理（分别为497.89 μg·L-1和19.22%）。醇类香气物质主要是1-己醇、反式-2-己烯-1-醇和2-乙基己醇（图3）。在始熟期，以A处理为对照，B处理使果实中1-己醇的含量增加了74.60 μg·L-1、反式-2-己烯-1-醇含量增加了28.26 μg·L-1，2-乙基己醇含量减少了788.41 μg·L-1；
而在成熟期，B处理使果实中2-乙基己醇含量增加了87.37 μg·L-1。总而言之，高叶果比在转色期和成熟期能增加‘玫瑰香’葡萄果实特征香气醇类物质的含量，而在始熟期醇类物质含量低于低叶果比处理。
2.1.3 萜烯类香气物质的分析
‘玫瑰香’果实中的萜烯类物质主要是香叶醇、里哪醇、β-蒎烯和香茅醇，其含量随着果实成熟逐渐增加（图4）。在始熟期，B处理果实中的香叶醇和β-蒎烯含量比A处理分别高90.82、37.95 μg·L-1；
在成熟期，B处理果实中的香叶醇和里哪醇含量比A处理分别高48.02、68.42 μg·L-1。以上结果说明，在转色期后，高叶果比能增加‘玫瑰香’葡萄果实特征香气萜烯类物质含量。
2.1.4 酮类香气物质的分析
‘玫瑰香’果实中酮类物质主要是6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-辛酮和2-壬酮（图5），随着果实的成熟，酮类物质逐渐减少，高叶果比可增加果实中6-甲基-5-庚烯-2-酮含量，而其他酮类物质变化不大。综上所述，在成熟期之前，高叶果比可增加果实香气中酮类物质的含量。
2.2 不同叶果比对‘玫瑰香’果实香气相关基因表达的影响
2.2.1 不同叶果比下果实萜烯类香气相关基因的表达
图6所示，以处理A为对照，在转色期处理B在HDR和CCD1基因的表达上调，LIS和NCED基因表达下调；
在始熟期，HDR和NCED基因表达与对照没有明显变化，LIS和CCD1基因的表达上调；
在成熟期，HDR和CCD1基因表达均上调，LIS基因表达下调，NCED基因表达与对照没有明显变化。以上结果说明，16∶1的叶果比与8∶1的叶果比处理在影响‘玫瑰香’果实萜烯类香气部分相关基因表达相比较，高叶果比在转色期促进HDR和CCD1基因的表达，抑制LIS和NCED基因的表达；
在始熟期，促进LIS和CCD1基因的表达；
在成熟期，促进HDR和CCD1基因的表达，抑制LIS基因的表达。由此可见，高叶果比可在一定程度上促进‘玫瑰香’果实成熟期萜烯类香气部分相关基因表达，使萜烯类化合物含量增加。
2.2.2 不同叶果比下果实醇酯类香气相关基因的表达
图7表现了不同叶果比处理对‘玫瑰香’果实醇酯类香气相关基因表达的影响。以处理A为对照，处理B在转色期对LOXA、HPL1和ADH3基因表达与对照没有明显变化；
在始熟期，LOXA基因的表达下调，HPL1和ADH3基因表达与对照没有明显变化；
在成熟期，LOXA、HPL1和ADH3基因表达均上调。以上结果说明，在影响‘玫瑰香’果实醇酯类香气部分相关基因表达方面，16∶1的叶果比在转色期对LOA、HPL1和ADH3基因的表达影响不大，在成熟期促进了LOXA、HPL1和ADH3基因的表达。由此可见，高叶果比在一定程度上促进‘玫瑰香’果实成熟期醇酯类香气相关基因表达，使得醇类和醛类物质含量增多，但在转色期和始熟期对醇酯类香气相关基因表达的影响不大。
不同的叶果比会影响葡萄果实品质和产量。夏季修剪通过改变叶果比调节植物库源关系及改善树冠内微环境，使光合作用的利用率最大化，从而影响果实品质。香气是葡萄果实风味、品种特性的重要组成部分，也是衡量果实品质重要的指标之一[23-27]。试验结果表明，高叶果比可提高‘玫瑰香’葡萄果实香气物质含量。其主要原因可能是高叶果比叶面积大，使光合产物的合成量增多，果实中糖分含量增加，从而进一步促进果实成熟过程中次生代谢产物的积累，如葡萄香气物质的合成积累[28-31]。
里哪醇、香叶醇被认为是‘玫瑰香’葡萄果实中单萜类物质，是香气中的主要呈香成分[26]。在始熟期和成熟期，高叶果比分别增加了香叶醇和里哪醇物质的含量，使果实的香味更加浓郁，而萜烯类相关的基因也在始熟期及成熟期表达上调。研究表明，在单萜类生物合成过程中，单萜醇前体的累计能够使HDR基因表达上调。Reynolds等通过对‘霞多丽’葡萄疏穗处理的研究发现，在果实发育早期进行疏穗处理可以增加果实中游离态萜烯物质含量，这与该试验结果一致[32-33]。值得注意的是，在始熟期高叶果比反而使果实中醛类、醇类物质的含量下降；
除此之外，转色期含有少量大马酮，始熟期和成熟期未检测到此物质，可能是由于大马酮所在的降异戊二烯合成途径与脱落酸合成途径共用同一种底物，随着果实的成熟，脱落酸合成增加，大马酮合成相应减少。
综上所述，对于‘玫瑰香’品种来说，高叶果比在转色期增加酮类、醇类和醛类物质含量，而在始熟期减少醛类、醇类物质含量。高叶果比可在成熟期促进葡萄果实香气中萜烯类物质和醇酯类物质相关基因的表达，使得成熟期果实中萜烯类物质和醇酯类物质含量增加。因此，在实际生产中，较高叶果比可以通过提高光合作用效率增加‘玫瑰香’葡萄果实香气化合物的合成。
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