吴妙鸿，方 灵，司瑞茹，傅建炜*
(1.福建省农业科学院亚热带农业研究所， 福建 漳州 363005；
2.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室， 福建 福州 350003)
姜黄CurcumaLongaL.是姜科姜黄属Curcuma植物根茎的统称，盛产于亚洲国家(如中国、孟加拉国、泰国、柬埔寨、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾等)和南美国家(如秘鲁、玻利维亚)[1-2]，姜黄素类化合物是姜黄中一类重要的次级代谢产物，属于多酚类物质，根据其苯环侧链取代基不同，姜黄素类化合物可进一步分为姜黄素(curcumin, CurI )、脱甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin, CurII)、双脱甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin, CurIII)等[3]。姜黄素在中国和印度等国家的利用已有数千年的历史[4]，大量研究表明姜黄素具有抗炎、抗氧化、镇痛、抗疟疾、抑菌、保肝、保护神经、抗肿瘤等生物活性[5-9]，因此近年来姜黄素在医药、食品、化妆品、饲料等行业的利用受到极大的关注[10]。姜黄素还具有很好的着色性，有研究表明姜黄素的着色效果优于其他天然黄色素，如胡萝卜素、栀子黄和玉米黄[11]，在GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中，姜黄和姜黄素被列为食品添加剂，可作为着色剂用于食品中。随着人们健康意识的逐步提升，人工色素由于其潜在的危害性为消费者所诟病，姜黄素产品作为着色性好、无毒副作用，且具有较强生物活性的天然色素[12]，已成为国内外重要食品添加剂。
当前我国已开发出水溶性和油溶性姜黄色素产品，根据性状可分为粉状、液体和晶体，还可通过多种复配调配出不同颜色[13]，市面上的姜黄素产品种类繁多，但由于原料选用和生产工艺的不同，质量良莠不齐，影响了其在食品中的使用效果和产业的健康发展。目前，关于市售姜黄素产品品质的研究还鲜见报道，本研究采用UPLC法测定5种市售姜黄素产品中姜黄素类化合物含量，分析对比其DPPH、ABTS、超氧阴离子自由基清除能力、总抗氧化能力和脂质过氧化抑制能力，并将其与实验室自制姜黄素进行对比，以期对不同姜黄素产品的品质有初步了解，为姜黄素产品的品质评价和加工利用提供参考。
1.1 材料与试剂
供试样品：5种姜黄素产品均为食品级，购自佛山市康能生物科技有限公司、优宝嘉食品旗舰店、美味滋食品配料商城、山东中天生物科技有限公司和河南祥意商贸有限公司，简称样品C1～C5，实验室自制姜黄素为对照，简称样品EC。姜黄药材购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司。
试剂：抑制超氧阴离子自由基(O2-·)测试盒、总抗氧化能力测试盒(南京建成生物工程研究所)；
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(美国Sigma公司)；
冰醋酸、无水乙醇、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、EDTA-Na2、VC(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；
三氯乙酸、卵磷脂、FeSO4·4H2O、2-硫代巴比妥酸、二丁基羟基甲苯(butylatedhydroxy toluene,BHT)(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)；
乙腈(HPLC级，德国Merck公司)；
姜黄素(CurI)、脱甲氧基姜黄素(CurII)和双脱甲氧基姜黄素(CurIII)标准品(纯度>98%，坛墨质检-标准物质中心)。
1.2 主要仪器设备
SPD-M40超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；
BS110S分析天平(德国Sartorius集团)；
PC650超声波细胞破碎仪(上海皓庄仪器有限公司)；
CR22N高速冷冻离心机(日本HITACHI公司)；
RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；
UPW-20N超纯水机(北京历元电子仪器有限公司)；
GZX- 9246MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)；
L5S紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；
iMark酶标仪(美国Biorad公司)。
1.3 试验方法
1.3.1实验室自制姜黄素(EC)提取制备 用研磨机将姜黄粉碎，过80目筛，在姜黄粉末中按1∶80(g∶mL)的料液比加入70%乙醇溶液，以240 W的功率超声破碎30 min，于摇床中以300 r·min-1振摇提取1 h，随后以4 000 r·min-1离心15 min，收集上清液，重复提取2次，合并上清液，提取液在50℃下减压旋转蒸发至无乙醇味，再将除去乙醇的提取液冷冻干燥即得姜黄素提取物(EC)。
1.3.2姜黄素类化合物含量测定 色谱条件[14]为色谱柱：SunFire C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，3.5 μm，美国沃特世公司)；
柱温：30℃；
流动相：(A)乙腈，(B)0.5%乙酸水；
等度洗脱：50% A+50% B；
进样体积：10 μL；
流速：1.0 mL·min-1；
检测波长：425 nm。
标准品溶液制备和测定。分别精确称取10 mg姜黄素(CurI)、脱甲氧基姜黄素(CurII)和双脱甲氧基姜黄素(CurIII)标准品，用色谱纯甲醇定容至10 mL，配制成1.0 mg·mL-1标准品储备液。精确量取储备液，用甲醇将CurI稀释成浓度梯度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0 μg·mL-1，将CurII、CurIII稀释成浓度梯度为0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 μg·mL-1的标准品工作液，利用上述色谱条件进行测定，以质量浓度为横坐标(x，单位：μg·mL-1)，峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，3个标准品的回归方程、R2和保留时间见表1。
表1 姜黄素类化合物回归方程
供试品溶液制备与测定。称取5种市售姜黄素产品、实验室自制姜黄素EC各10 mg，甲醇定容至100 mL，配制成0.1 mg·mL-1溶液，用0.22 μm有机相滤膜过滤，取滤液待测。
1.3.3抗氧化活性测定 DPPH、ABTS自由基清除能力测定参照文献[15-16]的方法。自由基清除能力以清除率为50%时样品的质量浓度(IC50)评价，以VC作为阳性对照。
O2-·自由基清除能力的测定参考周丽娟等[17]的方法，采用抑制O2-·自由基测试盒测定，将1 mgVC清除O2-·自由基的能力定义为1个活力单位(U)，以每克样品清除自由基的活力单位(U·g-1)评价样品的O2-·自由基清除能力，以VC作为阳性对照。
总抗氧化能力测定采用铁离子还原能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)法，用总抗氧化能力测试盒(FRAP法)测定，总抗氧化能力以每克样品将Fe3+还原成Fe2+的量计，单位为mmol·g-1，以VC作为阳性对照。
脂质过氧化(LPO)抑制活性测定参考韦会平等[18]的方法稍做修改。在150 mL磷酸盐缓冲液(10 mmol·L-1，pH 7.0，提前冷冻至4℃)中加入1 g卵磷脂，漩涡振荡至完全溶解。取0.5 mL卵磷脂溶液，依次加入1.0 mL磷酸盐缓冲液、0.5 mL样品溶液和1.0 mL 2.5 mmol·L-1EDTA Na2-Fe2+溶液，充分混匀后在37℃下水浴反应45 min，随后依次加入2.0 mL浓度为28%的三氯乙酸溶液和1.0 mL浓度为1%的2-硫代巴比妥酸溶液，充分混匀后置于沸水浴中反应10 min，由于体系中的油脂使溶液呈浑浊状态，因此反应液冷却后需以8 000 r·min-1离心4 min，最后取上清液在532 nm下测定吸光值，以磷酸盐缓冲液调零。LPO抑制活性计算公式如下：
式中，A0为空白组，即磷酸盐缓冲液代替样品溶液的吸光值；
Ab为本底组，即磷酸盐缓冲液代替2-硫代巴比妥酸溶液的吸光值；
As为样品组或阳性对照组的吸光值，以BHT作为阳性对照。
1.3.4数据处理 所有试验均重复3次，数据以平均值±标准偏差表示。试验数据采用Excel 2007进行回归分析，显著性采用SPSS 22.0统计软件通过Duncan法分析，双变量相关性采用SPSS 22.0软件通过Pearson法分析。
2.1 不同产品的姜黄素类化合物含量比较
姜黄素类化合物混标和不同姜黄素产品的色谱图见图1，在该色谱条件下，3种姜黄素类化合物分离理想，峰形好、无其他物质干扰，6个样品的色谱图中姜黄素类化合物的相对峰面积均有所差异。
注：姜黄素类化合物混标上机浓度为0.5 μg·mL-1，姜黄素产品上机浓度为0.1 mg·mL-1
由表2可知，5种市售姜黄素中，CurI含量以样品C5的最高，其余4个样品无显著差异；
CurII含量均无显著差异；
CurIII含量以样品C1和C4较高，其余样品无显著差异；
总姜黄素含量排序为：C5>C1>C4>C2>C3，C5与C1、C4、C2无显著差异，但显著高于C3。不同姜黄素产品中CurⅠ、CurⅡ、CurⅢ的含量比例有较大差异，C2、C3、EC均表现为CurⅠ>CurⅡ>CurⅢ，C1、C4均表现为CurⅠ=CurⅢ>CurⅡ，C5则表现为CurⅠ>CurⅡ>CurⅢ，这可能是姜黄原料不同所导致的。市售姜黄素中总姜黄素类化合物含量为1.278～2.188 g·hg-1，方恩华等[19]研究了食品级商业姜黄素添加剂中的姜黄素类化合物含量，发现粉末状和油溶姜黄色素的总姜黄素含量分别为1.33、2.96 g·hg-1，本研究结果与其接近。EC中3种姜黄素类化合物和总姜黄素含量均显著高于市售姜黄素(P<0.05)。
表2 不同产品姜黄素类化合物含量及比例
2.2 不同产品的抗氧化活性比较
2.2.1DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一种稳定自由基，其结构中心氮桥一侧氮原子上有一个未成对电子，自由基清除剂可与未成对电子配对，从而达到清除自由基的效果。姜黄素产品对DPPH自由基具有显著清除能力，其质量浓度与DPPH自由基清除率呈线性正相关关系(表3)，对比IC50值可知，市售姜黄素的清除能力大小排序为C5>C3>C2>C4>C1，其中C5与C3、C2间无显著差异(P>0.05)，但显著高于C4和C1。EC的DPPH自由基清除能力显著高于市售姜黄素，为其7～15倍。所有姜黄素产品清除DPPH自由基的能力均显著低于阳性对照VC(P<0.05)。
表3 不同姜黄素产品的抗氧化活性比较
2.2.2ABTS自由基清除能力 不同姜黄素产品对ABTS自由基均有显著清除能力，且与其质量浓度呈对数函数关系(表3)。对比IC50值可知，市售姜黄素清除能力大小表现为C5>C2>C3>C4>C1，其中C5与C2、C3间无显著差异，但显著高于C4和C1，这与其DPPH自由基清除能力的情况相一致。EC的ABTS自由基清除能力显著高于市售姜黄素，为其13～24倍。阳性对照VC清除ABTS自由基的能力显著高于所有姜黄素产品。
2.2.3LPO抑制活性 脂质过氧化(LPO)是指脂类的多不饱和脂肪酸与自由基通过一系列链式反应形成脂质过氧化自由基的反应过程[20]，姜黄素的LPO抑制活性，表征了其抑制油脂氧化的能力，对于研究姜黄素产品在肉制品中的应用价值具有一定指导意义。姜黄素产品均具有一定的LPO抑制活性，且与其质量浓度呈对数函数关系，不同产品抑制LPO的IC50见表3，市售姜黄素活性大小表现为C5>C3>C2>C4>C1，排序与其DPPH自由基清除能力的情况一致，与ABTS自由基清除能力接近。EC的LPO抑制活性显著高于市售姜黄素，是其12～21倍。阳性对照BHT的LPO抑制活性高于所有姜黄素产品。
2.2.4O2-·自由基清除能力 O2-·自由基是基态氧接受一个电子形成的氧自由基，作为生物体代谢过程中产生的自由基，可以攻击核酸、蛋白、脂质等生物大分子，引起细胞结构和功能的破坏，与机体的组织损伤有密切联系[21]。由表3可知，姜黄素产品具有一定的O2-·自由基清除能力，但均比较弱，显著低于阳性对照VC(P<0.05)。C1、C4、C5的清除能力无显著差异，而C2和C3没有清除O2-·自由基的能力，EC的清除能力则显著大于5种市售姜黄素(P<0.05)。
2.2.5总抗氧化能力 样品的总抗氧化能力是指将Fe3+还原成Fe2+的能力，反映了抗氧化剂的电子转移能力。由表3可知，市售姜黄素产品均具有一定的总抗氧化能力，表现为C2>C5>C3>C4>C1，5种市售姜黄素的总抗氧化能力差异不显著(P>0.05)，但均显著低于EC(P<0.05)，阳性对照VC的总抗氧化能力显著高于所有姜黄素产品。
2.3 姜黄素类化合物含量与抗氧化活性的相关分析
由表4可知，3种姜黄素类化合物和总姜黄素的含量与DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、LPO抑制活性、O2-·自由基清除能力、总抗氧化能力均呈极显著正相关关系(P<0.01,0.976≤r≤0.999)，说明样品中姜黄素类化合物含量对其抗氧化能力强弱具有重要影响。
表4 姜黄素类化合物含量与抗氧化活性的相关性
本研究对比了不同姜黄素产品的功能成分含量和抗氧化活性，结果表明5种市售姜黄素的总姜黄素类化合物含量范围为1.278～2.188 g·hg-1，而实验室自制姜黄素EC的总姜黄素含量则为16.655 g·hg-1，显著高于市售姜黄素，原因一方面是因为工业化生产市售姜黄素时姜黄素类化合物提取率低、纯度不高；
另一方面是为使姜黄素在食品中能形成稳定的体系、改善姜黄素的性状或降低生产成本，大部分姜黄素产品是将姜黄素与乳化剂、麦芽糊精等物质进行复配的二次加工品，因此市售姜黄素产品中姜黄素类化合物含量偏低。不同姜黄素产品均具有显著的抗氧化活性，但存在一定差异。5种市售姜黄素中，DPPH、ABTS自由基清除能力和LPO抑制活性以C5最强，O2-·自由基清除能力以C1最强，总抗氧化能力以C2最强，EC的抗氧化活性均显著高于5种市售姜黄素。
为研究姜黄素产品的姜黄素类化合物含量与抗氧化活性之间的关系，本试验对二者的相关性进行分析，结果表明3种姜黄素类化合物的含量与DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、LPO抑制活性、O2-·自由基清除能力、总抗氧化能力均呈极显著正相关关系(P<0.01, 0.976≤r≤0.999)。已有许多研究表明姜黄素类化合物具有显著的抗氧化活性，张艳等[22]研究发现CurⅠ、CurⅡ和CurⅢ三者清除DPPH自由基、ABTS自由基的IC50分别为4～7、1.5～7 μg·mL-1；
孙鹏尧[23]测得姜黄提取纯化液清除DPPH自由基、ABTS自由基的IC50分别为18.18、28.89 μg·mL-1；
Jayaprakasha等[24]研究发现CurⅠ、CurⅡ、CurⅢ能显著抑制亚油酸过氧化，其抑制率分别达到81.98%、81.77%和73%。唐传核等[25]认为姜黄素清除自由基的过程分为捕获自由基和中止自由基两个阶段，和大多数酚类物质一样，姜黄素的邻-二羟基基团使其能够捕获自由基，随后吸附了自由基的姜黄素经氧化反应可生成具有稳定二氢呋喃结构的非自由基物质，从而发挥抗氧化的作用。综合上述研究结果，市售姜黄素的抗氧化活性和姜黄素类化合物含量，均显著低于实验室自制姜黄素，CurⅠ、CurⅡ、CurⅢ是姜黄素产品抗氧化活性的主要贡献物质。