孙梦晴，霍墨涵，姜晓文，李子俊，马 隽，葛 铭，于文会,2,3
(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；
2.东北农业大学中兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150030；
3.黑龙江省普通高校动物普通疾病防治重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)
节本增效是养殖场提高养殖效益的重要手段。养殖场在节本增效时，促进饲料转化，提高饲料报酬是最常用的方法。中药饲料添加剂可健脾胃，提高胃肠功能，促进消化酶的分泌。雏鸡的肠道健康，对其消化吸收、生长发育具有重要的意义[1]。中药具有多效性，有些中药具有促进胃肠蠕动，提高日粮中营养物质消化与吸收的作用，进而可提高饲料报酬[2]。有研究表明，中药饲料添加剂能显著改善断奶仔猪的生长性能，提高消化道内脂肪酶、淀粉酶等的活性[3-4]。山楂、枳壳、神曲等中药，可以促进饲料的消化吸收；
黄芪、刺五加等中药，可促进体内物质的合成与代谢，增加消化酶的活性[5]，促进营养物质消化吸收，提高养殖效益。
肠道菌群利用机体的各种酶和不同的代谢通路[6]，为自身和宿主提供一定的营养和能量，同时维持肠道黏膜屏障和系统自身的免疫功能[7]。因此，肠道微生物菌群对维护肠道的稳态，保障雏鸡肠道健康具有十分重要的作用[8-9]。于佳楠等[10]研究发现，基础日粮中添加黄芪、甘草、党参、陈皮、当归、白术和升麻能够改善芦花鸡肠道菌群的组成。刺五加性温，味辛、微苦，归脾、肾经，具有益气健脾的作用；
枳壳味苦、辛、酸，性微寒，归脾经，具有行滞消积的功效；
黄芪性甘，味微温，归肺、脾经，具有补气升阳、生津养血的作用。本研究通过在雏鸡饲料里添加不同剂量的复方刺五加中药，探讨复方刺五加中药对雏鸡消化吸收和对肠道菌群的作用效果，为复方刺五加中药的研发和在畜牧业中的应用提供参考。
1.1 材料
1.1.1 药品与试剂 将刺五加、枳壳、黄芪(均购自哈尔滨中药大市场)，按照2∶1∶1的比例进行配伍，经过粉碎机粉碎、过筛、混匀，组成复方刺五加；
胃蛋白酶活性试剂盒、脂肪酶活性检测试剂盒、淀粉酶活性检测试剂盒、糜蛋白酶活性检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；
4%多聚甲醛(含DEPC)、乙醇、丙酮、二甲苯、苏木精、伊红，均购自黑龙江久丰生物有限公司。
1.1.2 主要仪器 JY2002 型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品；
高速离心机，中国医药器机六厂产品；
生化分析仪，美国爱德士公司产品；
显微镜，江南永新产品。
1.1.3 试验动物 未经免疫的1日龄蛋鸡，购自哈尔滨先锋孵化场。
1.2 方法
1.2.1 试验鸡的饲养环境 试验前对鸡笼、饮水器、喂食器用新洁尔灭进行清洗消毒，浸泡2 h后取出，清水冲洗晾干即可使用。动物房消毒前关闭门窗，使用高锰酸钾熏蒸消毒法，消毒后通风换气48 h后方可使用。将64只雏鸡随机分为4个组，每组16只饲养于同一笼内。1～7日龄雏鸡生长最合适的温度为35 ℃左右，在每一鸡笼内安装热灯，为雏鸡生长提供适宜温度，湿度控制在65%左右；
7日龄后，环境温度每周可下降2 ℃。24 h保持温度均衡，高低温差不能超过3 ℃。动物饲养与试验符合东北农业大学实验动物福利管理规定。
1.2.2 试验分组与饲喂 分组：将64只雏鸡随机分为4个组，每组16只，分别为空白组、复方刺五加低剂量组(0.5 kg/t)、复方刺五加中剂量组(1.0 kg/t)和复方刺五加高剂量组(2.0 kg/t)。
饲喂：雏鸡适应饲喂7 d后开始正式试验，试验周期为21 d。每日早上和下午每笼各饲喂250 g对应组别的雏鸡饲料。将饮水器注满白开水，每日早、晚各换水1次，供雏鸡自行饮用。
1.2.3 雏鸡主要生长指标检测 体重检测：在正式试验第7、14天和第21天时分别在同一时间称量每组中每只雏鸡的体重并记录。
采食量检测：每日早上和下午每笼各饲喂250 g对应组别的雏鸡饲料，第2天饲喂前，清除托盘中的粪便，回收并称量每组剩余饲料,计算每日采食量。
每日采食量/g=500 g-回收饲料量/g。
料重比检测：料重比/%=试验期间每组雏鸡的饲料总摄入量/试验期间每组雏鸡的总增重×100%
1.2.4 雏鸡血清生化指标检测 21 d试验结束后，每组随机抽取3只体重相近的雏鸡，心脏采血2～3 mL于10 mL离心管，静置，3 000 r/min离心10 min，取上层血清至EP管，-20 ℃保存。用生化分析仪检测每组总蛋白(TP)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、总胆固醇(TC)和血糖(GLU)含量。
1.2.5 雏鸡胃肠消化酶活性检测 21 d试验结束后，每组随机取3只雏鸡处死，取腺胃组织和小肠组织。分别称取0.2 g腺胃组织和0.2 g小肠组织于研钵中，加入液氮研磨，加适量生理盐水，3 000 r/min离心10 min，取上清。ELISA检测胃蛋白酶活性、脂肪酶活性、淀粉酶活性和糜蛋白酶活性，检测方法参照说明书进行。
1.2.6 雏鸡小肠绒毛和隐窝深度检测 21 d 试验结束后，每组随机取3只雏鸡处死，每只取2 cm的小肠组织，4%多聚甲醛固定，24 h后水洗2 h，经过乙醇、丙酮固定、二甲苯脱水、透明后，进行包埋，切片，用苏木精和伊红(H.E.)染色，树胶封片，显微照相设备进行图像采集，进行组织切片绒毛高度、隐窝深度的测量。每组取5张切片观察、测定，取平均值。肠绒毛高度为从肠腺绒毛联结处到绒毛顶端的长度；
隐窝深度为从肠腺基部到肠腺绒毛联结处的长度，并计算绒毛高度与隐窝深度的比值。
1.2.7 雏鸡肠道菌群检测 21 d试验结束后，每组随机取3只雏鸡处死，每只取2 g盲肠内容物，用16S rDNA扩增子测序法测定肠道菌群。
1.2.8 数据统计方法 使用SPSS 20.0软件对结果进行单因素方差分析，并用Prism 8软件绘制柱状图，P<0.01表示存在极显著差异，P<0.05表示存在显著差异，P>0.05表示无显著差异。
2.1 雏鸡主要生长指标检测 如表1所示，与空白组比较，中剂量组雏鸡的平均体重极显著增长(P<0.01)，低剂量组显著增长(P<0.05)；
各组雏鸡平均日采食量均无显著性差异(P>0.05)；
与空白组比较，中剂量组雏鸡料重比极显著降低(P<0.01)，而高剂量组、低剂量组也呈显著降低(P<0.05)。
表1 雏鸡主要生长指标
2.2 雏鸡血清生化指标检测 如图1所示，与空白组比较，3个复方刺五加剂量组雏鸡GLU、TP、LDL、HDL、TC含量均有升高，其中GLU含量中剂量组极显著升高(P<0.01)，低剂量组、高剂量组显著升高(P<0.05)；
TP含量中剂量组极显著升高(P<0.01)，低剂量组、高剂量组显著升高(P<0.05)；
LDL含量3个复方刺五加剂量组均极显著升高(P<0.01)；
HDL含量中剂量组极显著升高(P<0.01)，高剂量组显著升高(P<0.05)；
TC含量中剂量组极显著升高(P<0.01)，低剂量组、高剂量组显著升高(P<0.05)。
图1 雏鸡血清生化指标
2.3 雏鸡胃肠道消化酶活性检测 如图2所示，与空白组比较，3个复方刺五加剂量组的胃蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性均有所增加，其中胃蛋白酶活性、糜蛋白酶活性中剂量组、低剂量组差异极显著(P<0.01)，高剂量组差异显著(P<0.05)；
脂肪酶活性、淀粉酶活性中剂量组差异极显著(P<0.01)，低剂量组、高剂量组差异显著(P<0.05)。
图2 雏鸡胃肠道消化酶活性
2.4 雏鸡小肠绒毛和隐窝深度检测 如图3所示，21 d试验结束后，各组黏膜面光整，黏膜皱壁完好；
腺体、隐窝、杯状细胞正常，未见炎性细胞浸润。各组绒毛长度和隐窝深度比值测量结果见图4，空白组绒毛平均长度为715.46 μm，隐窝深度为126.08 μm；
低剂量组绒毛平均长度为418.21 μm，隐窝深度为65.69 μm；
中剂量组绒毛平均长度为1 063.63 μm，隐窝深度为163.40 μm；
高剂量组绒毛平均长度为862.51 μm，隐窝深度为142.00 μm；
与空白组相比，绒毛长度与隐窝深度的比值中剂量组极显著升高(P<0.01)，低剂量组、高剂量组显著升高(P<0.05)。
图3 雏鸡小肠黏膜组织切片(H.E.染色，400×)
图4 雏鸡小肠绒毛长度和隐窝深度比值
2.5 雏鸡肠道菌群检测
2.5.1 OTU分析 如图5所示，图中不同颜色的花瓣代表不同的分组及其特有 OTU 个数，花瓣重叠部分的数字代表所有分组共有的 OTU 个数。空白组有470个OUT、低剂量组有610个OTU、中剂量组有513个OTU、高剂量组有586个OTU。与空白组比较，低剂量组独有230个OTU、中剂量组独有144个OTU、高剂量组独有209个OTU。结果表明与空白组比较，3个复方刺五加剂量组菌群多样性均有所增加。
图5 各组雏鸡肠道菌群OTU韦恩图
2.5.2 Alpha多样性分析 雏鸡肠道菌群稀释性曲线图中，在一定范围内，群落中有大量物种被发现时曲线表现为急剧上升；
物种不随测序数量的增加而增多时，曲线趋于平缓。由图6A可知，多样性由多到少依次为中剂量组、低剂量组、高剂量组和空白组。雏鸡肠道菌群等级丰度曲线图中，横轴上的长度反映物种的丰富度，曲线越宽，物种的组成越丰富；
曲线的形状反映物种组成的均匀度，曲线越平坦，物种组成的均匀度越高。由图6B可知，各组丰富度由大到小依次为中剂量组、低剂量组、空白组和高剂量组。
图6 Alpha多样性分析结果
2.5.3 基于门水平差异性分析 如图7所示，前10种菌群分别为硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、E-变形菌门(Epsilonbacteraeota)、柔膜菌门(Tenericutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。其中占比例最多的3种菌群为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)；
与空白组比较，3个复方刺五加剂量组中厚壁菌门占比均增加，中剂量组增幅最大；
3个复方刺五加剂量组中拟杆菌门占比均降低，中剂量组降低幅度最明显；
3个复方刺五加剂量组中变形菌门中剂量组占比降低，低剂量组和高剂量组占比升高。
图7 各组雏鸡肠道菌群基于门水平差异性分析
3.1 复方刺五加对雏鸡消化吸收功能的影响 脾主运化，胃主受纳、熟腐水谷[11]。复方刺五加由刺五加、枳壳、黄芪等组成，具有燥湿运脾、行气和胃的作用。有研究表明，刺五加含有的微量元素和氨基酸等可以促进动物机体的食欲，并提高动物机体的免疫力[12-13]；
枳壳因具有行滞消胀、理气宽中的功效[14]，对食积气滞具有调节疏通作用[15]。本研究对主要生长指标检测的结果显示，每只雏鸡的平均体重与初始体重比较，空白组增加了169 g、低剂量组增加了184 g、中剂量组加了211 g、高剂量组增加了178 g；
在料重比方面，中剂量组的料重比最低，为23.38%，与空白组相比降低了4.2%。料重比反映了饲料利用率，鸡的饲料利用率是肉鸡生产中最重要的经济指标。一般来说，料重比越低，饲料利用率越高，投入的饲料少而雏鸡体重增加的多，同比，经济效应也好。本研究对血清生化指标检测的结果显示，3个复方刺五加剂量组的血清总蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇和血糖含量均有所升高，其中中剂量组与空白组相比增加极显著(P<0.01)，说明复方刺五加能够促进雏鸡体内蛋白质的合成、脂质代谢和糖代谢。本研究对胃肠道消化酶检测结果显示，3个复方刺五加剂量组胃肠道中胃蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的含量与空白组相比较均显著增加(P<0.05或P<0.01)，表明复方刺五加能够明显地提高小肠中各消化酶的活性。小肠的主要作用是消化吸收、受盛化物、分清泌浊。小肠中十二指肠的绒毛最长。小肠绒毛有规律的摆动有利于阻碍有害细菌在肠黏膜上的黏附，肠绒毛形态结构的完整性与机体的生长发育密切相关[16]，小肠的生长发育情况可以通过肠道绒毛与隐窝的比值来反映。本研究对小肠绒毛长度与隐窝深度的比值的检测结果显示，与空白组比较，中剂量组的小肠绒毛形态生长发育更好，十二指肠绒毛的长度和隐窝深度的比值升高极显著(P<0.01)，低剂量组和高剂量组升高显著(P<0.05)。本研究结果表明，复方刺五加能够提高肠绒毛的长度和隐窝深度的比值，促进雏鸡肠道的发育，提高肠道的消化吸收功能。
3.2 复方刺五加对雏鸡肠道菌群的影响 家禽生产性能除了受到日粮、饲养环境和遗传等因素影响外，肠道微生物及其代谢产物也是一个重要的影响因素[17]。本研究中，3个复方刺五加剂量组菌群多样性与丰富度与空白组相比均增多，中剂量组增加最明显；
3个复方刺五加剂量组肠道菌群中占比最多的3种为拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门；
3个复方刺五加剂量组与空白组比较，厚壁菌门占比均增加，中剂量组增加最明显；
拟杆菌门占比均降低，中剂量组降低最明显；
变形菌门中剂量组占比降低，低剂量组和高剂量组占比升高。厚壁菌门和拟杆菌门的占比增加促进了脂肪代谢和糖类代谢[18]，增加机体对营养物质的吸收，从而提高肠道的消化吸收，促进机体生长发育。变形菌门的细菌大多数为兼性厌氧菌[19]，因为肠道内缺氧所以变形菌门在正常的肠道中含量很少，而且很多都是有害菌群。变形菌门占比降低使肠道内致病菌减少，降低了对肠道的损伤作用。本研究结果表明，复方刺五加能增加肠道菌群的丰富度和多样性，影响变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门在肠道菌群中的占比，保护肠道健康，促进了肠道的消化吸收。综上可知，复方刺五加能够提高雏鸡消化吸收功能，增加肠道菌群的多样性并提高益生菌群丰度，促进饲料转化和生长发育。