赵惠临 ，纪 元 ，杨 帆，杨致亭
(1山西省临汾市中心医院检验科，山西 临汾 041000；
2山东第一医科大学山东省医学科学院检验科，济南 271016；
3山东康华生物医疗科技股份有限公司，山东 潍坊 261023)
据统计全球有3.5%的人口是慢性乙型肝炎病毒(Chronic hepatitis B virus，HBV)感染者，在病毒性肝炎相关死亡患者中，慢性HBV感染所占比例高达65%[1]。肝纤维化是慢性HBV感染疾病进展的标志。因此早期准确识别肝纤维化和肝硬化、及时进行抗病毒治疗，对阻断疾病进展，改善患者预后具有关键性作用。目前，肝脏穿刺活组织检查仍是进行肝纤维化分期的金标准，但肝活检是一种侵入性手术，存在有创性、价格昂贵、采样偏差等缺点，有些患者不愿意接受肝活检以评估疾病的严重程度，导致延误及时的抗病毒治疗[2]。近年来的证据表明，长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)作为一种相对稳定的遗传分子标志，在肝纤维化的鉴别诊断中发挥重要作用[3]。尤其是血清外泌体中的LncRNA结构稳定，适用于常规检测。核富集转录体1(Nuclear abundant enriched transcripts，NEAT1)是一种与肝纤维化发生、发展密切相关的LncRNA[4]。研究发现[5]，血清外泌体LncRNA NEAT1在非酒精性脂肪性肝病肝纤维化中具有一定诊断价值。本研究采用受试者工作特征(Receiver operator characteristic，ROC)曲线分析的方法研究血清外泌体中LncRNA NEAT1检测在慢性HBV感染者不同程度肝纤维化中的诊断价值，现报道如下。
1.1研究对象选择2018年1月-2021年6月在山西省临汾市中心医院消化科就诊的314例慢性HBV感染者为研究对象，其中男性184例，女性130例，平均年龄38.18±4.97岁，平均BMI为24.04±3.29 kg/m2。患者诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》中的标准，并按慢性肝炎分级标准中的病理诊断标准[6]进行纤维化程度分期，S0～1期患者178例，S2期患者67例，S3期患者33例，S4期患者36例。纳入标准：(1)年龄18-70岁；
(2)乙型肝炎表面抗原阳性超过6个月。排除标准：(1)近一年内接受过抗病毒药物、免疫抑制剂、激素类药物治疗；
(2)合并其他肝病，如脂肪肝、自身免疫性肝炎或药物性肝损伤等；
(3)患有严重心、脑、肾疾病、恶性肿瘤或内分泌疾病；
(4)合并其他急慢性病毒感染性疾病，如人乳头瘤病毒感染、流行性感冒等。本研究通过山西省临汾市中心医院伦理委员会的批准(批号：2021-19-8号)，研究对象均自愿参与研究，并签署知情同意书。
1.2方法
1.2.1 血液标本、临床指标和炎性因子水平的收集 于肝穿刺当日清晨抽取患者5 mL空腹外周静脉血，存于EDTA抗凝管中，离心后取上层血清置于-20℃冰箱中待用。于2 h内采用全自动生化分析仪检测血常规及肝功能指标，记录白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。采用PCR荧光探针法测定研究对象血清中的HBV-DNA含量。采用化学发光法检测研究对象血清中白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、IL-12和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。
1.2.2 血清外泌体的提取及鉴定 采用美国Invitrogen公司生产的总外泌体分离试剂和超速离心法从血清样品中分离出外泌体。采用电镜检测外泌体大小及形态，采用Nano FCM Flow及Nano Analyzer测定样品粒径及浓度。
1.2.3 血清外泌体LncRNA NEAT1表达量的检测 采用美国invitrogen公司生产的Trizol试剂从外泌体样本中提取出总RNA。取0.5～1.0 μg的RNA作为逆转录模板，采用NCBI BLAST设计NEAT1引物：正向5’-GGCAGG TCTAGTTTGGGCAT-3’，反向5’- CCTCATCCCTCCCAGTACC-3’。采用实时定量聚合酶联反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)测定LncRNA NEAT1表达量。采用 SYBR Green Mix 试剂盒(GoTaq qPCR Master Mix；
美国 Promega 公司)配制 25 μL PCR反应体系。PCR步骤如下：95℃ 8 min，1个循环；
95℃ 15 s，62℃ 38 s，73℃ 15 s，40个循环，对每个样本设置3次重复实验。采用β-actin作为内参，引物序列为：正向5’-ATATTCTCTCCGTTCCAATGA-3’；
反向5’-CTGCTGCTTCGACCCTTTCCCTG-3’。应用 2-ΔΔCT法计算NEAT1的相对表达量。
2.1不同程度肝纤维化患者的临床指标及炎性因子水平比较4组患者的性别、年龄、BMI和HBeAg比较，差异无统计学意义(P>0.05)；
4组患者间血清WBC、PLT、ALT、AST、HBV DNA、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 不同肝程度肝纤维化患者的临床指标及炎性因子水平比较
2.2不同程度肝纤维化患者中的血清外泌体LncRNANEAT1水平比较S0～1、S2、S3、S4组患者血清外泌体LncRNA NEAT1的相对表达量分别为1.12±0.53、1.35±0.14、1.82±0.20和1.99±0.26，两两比较结果显示差异均有统计学意义(P<0.05)，即随着肝纤维化分期的增加，血清外泌体LncRNA NEAT1的相对表达量也随之升高。
2.3血清外泌体LncRNA NEAT1水平与不同程度肝纤维化患者临床指标及炎性因子水平的相关性S0～1组患者血清外泌体LncRNA NEAT1水平与HBV DNA水平有显著正相关关系(P<0.05)；
S2组患者血清外泌体LncRNA NEAT1水平与IL-12、TNF-α水平呈显著正相关关系(P<0.05)；
S3组患者血清外泌体LncRNA NEAT1水平与ALT、AST、HBV DNA、IL-10、IL-12、TNF-α水平呈显著正相关关系(P<0.05)；
S4组患者血清外泌体LncRNA NEAT1水平与IL-6、IL-12和TNF-α水平呈显著正相关关系(P<0.05)，见表2。
表2 血清外泌体LncRNA NEAT1水平与不同程度肝纤维化患者临床指标及炎性因子水平的相关性
2.4血清外泌体LncRNA NEAT1水平对不同程度肝纤维化的诊断价值肝纤维化分期≥S2为显著肝纤维化(136例)，≥S3期为严重肝纤维化(69例)，S4期为肝硬化(36例)。ROC曲线分析结果显示，血清外泌体LncRNA NEAT1水平诊断显著肝纤维化的AUC为0.928(0.900～0.956)，以1.24为截断值，灵敏度和特异度分别为83.8%和88.8%；
血清外泌体LncRNA NEAT1水平诊断严重肝纤维化的AUC为0.767(0.702～0.833)，以1.42为截断值，灵敏度和特异度分别为59.4%和84.9%；
血清外泌体LncRNA NEAT1水平诊断肝硬化的AUC为0.883(0.812～0.953)，以1.59为截断值，灵敏度和特异度分别为80.6%和86.7%，见表3。
表3 血清外泌体LncRNA NEAT1水平对不同程度肝纤维化的诊断价值
HBV慢性感染后起病隐匿，肝纤维化是慢性HBV感染进展到肝硬化甚至肝癌的重要阶段。血清外泌体中的LncRNA已被证实在与肝纤维化发生机制和疾病进展有关的多种生物学过程的调控中发挥重要作用[7]。
本研究对不同程度肝纤维化患者的临床指标及炎性因子水平水平进行了比较，结果显示≥S2期的患者WBC、PLT、ALT、AST、HBV DNA、IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的水平均显著高于S0～1期患者，这与胡庆刚等[8]报道的结果一致。之前的研究[9]表明，当肝细胞受到病毒侵袭后，应激反应导致中性粒细胞活化聚集，肝细胞会释放出大量炎性细胞因子进入血液循环中，随着疾病进展，炎症细胞因子分泌增多，加重炎症侵袭程度，从而导致ALT、AST等肝功能指标的升高。张文良等[10]的研究也表明IL-6在肝纤维化患者中的表达水平显著升高，IL-6可通过影响细胞外基质的合成与降解参与到肝纤维化的发生过程中。对不同程度肝纤维化患者中的血清外泌体LncRNA NEAT1水平进行了比较，结果显示，随着肝纤维化程度的加重，血清外泌体LncRNA NEAT1的相对表达量也随之升高。血清外泌体LncRNA NEAT1的相对表达量与不同肝纤维化程度慢性HBV感染者的肝功能指标及血清炎症因子呈显著正相关关系。这一结果提示，血清外泌体LncRNA NEAT1与慢性HBV感染者肝纤维化的发生、发展有关。
动物实验显示，在肝纤维化小鼠模型中上调LncRNA NEAT1表达，并可通过竞争性结合微小RNA-122和kruppel样因子6加速原代肝星状细胞活化，从而促进肝纤维化的进展[11]。Ye等[12]研究证实NEAT1可以促进非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease ，NAFLD)患者的肝纤维化进程，NEAT1表达量升高可通过调控微小RNA-129-5p/细胞因子信号2轴调节肝组织纤维化、炎症反应和脂质代谢。表明LncRNA NEAT1在肝组织纤维化的发生、发展中属于重要的诱导因子。王艳等[5]的研究也表明，肝纤维化NAFLD患者血清外泌体 LncRNA NEAT1显著高于非肝纤维化NAFLD患者及正常对照者，并且血清外泌体 LncRNA NEAT1水平可为NAFLD患者肝纤维化的诊断以及疾病进展评估提供有效的参考价值。此外，Yu等[11]通过动物性实验表明，在四氯化碳诱导的小鼠肝组织纤维化模型中，LncRNA NEAT1表达显著增加，还可上调NEAT1表达，通过调节miR-122/KLF6信号轴可加速原代肝星状细胞活化，包括促进细胞增殖和胶原蛋白表达。Jin等[13]的研究证实，NEAT1可以促进NAFLD患者的肝纤维化进程，通过脂肪酸诱导BRL3A细胞建立NAFLD体外细胞模型，在这个过程中，NEAT1表达量逐渐升高，并且可以海绵化吸附miR-506来抑制Gli3的表达，进而调节肝组织纤维化、炎症反应和脂质代谢。上述研究均说明，LncRNA NEAT1在肝组织纤维化早期阶段属于重要的诱导因子。本研究分析了血清外泌体LncRNA NEAT1水平对不同程度肝纤维化的诊断价值，结果显示，血清外泌体LncRNA NEAT1水平诊断显著肝纤维化的灵敏度和特异度分别为83.8%和88.8%，诊断严重肝纤维化的灵敏度和特异度分别为59.4%和84.9%，诊断肝硬化的灵敏度和特异度分别为80.6%和86.7%。因此，采用不同的截断值在诊断显著纤维化及肝硬化中，血清外泌体LncRNA NEAT1检测具有较高的效能，但在鉴别严重肝纤维化患者还存在一定局限性。
综上所述，随着HBV感染者肝纤维化分期的增加，血清外泌体LncRNA NEAT1的相对表达量也随之升高，且血清外泌体LncRNA NEAT1水平检测有助于对HBV感染者显著肝纤维化和肝硬化的诊断。
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