王妍璐，彭伟康，梁嘉乐，马卫列，丁 航，张志珍，陈晓佳*（广东医科大学.第二临床医学院；
.技术学院；
.基础医学院，广东东莞 5808）
据估计，全球1/4 的人口患有非酒精性脂肪肝（NAFLD），预计未来10 年非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的发病率将增加56%，NASH 如不及时治疗，可出现肝纤维化（HF），最终发展成肝细胞癌（HCC）[1-2]。由于肥胖率增加，HF 相关的HCC 发病率逐年上升[3]，亟需构建一种与人类HF 发生和发展高度相似的动物模型进行HF 的预防和治疗的研究。目前构建HF 动物模型主要有基因工程鼠、肝毒性药物诱导鼠和高脂饮食诱导鼠[4-5]，其中基因工程鼠成本高[6]；
肝毒性药物诱导虽然建模时间快但与人的HF 发生发展不符，且不稳定[7]；
高脂饮食诱导HF 模型与人的HF 发生、发展模式相近[8-9]。沙鼠血脂代谢与其他实验动物存在很大差别，其血脂对高脂饲料反应敏感，且其载脂蛋白变化与人类相似，被认为是高脂血症良好的研究模型[10]。本课题组前期研究显示，采用89%基础饲料+1%胆固醇+l0%猪油配方的高脂饲料可构建与人类高脂血症一致的高血脂动物模型[11]，故本实验在高脂血症沙鼠模型的基础上构建NAFLD 模型，延长高脂喂养时间，模拟人类HF 由NAFLD 发展的过程，构建稳定的与人类HF 发生、发展高度一致的HF 沙鼠模型。
1.1 仪器与材料
1.1.1 仪器 5417R 高速台式离心机（Eppendorf 公司）；
7180 型全自动生化分析仪（HITACHI 公司）；
SYNERGY H1 酶标仪（Biotek 公司）。
1.1.2 实验动物与材料 30 只清洁级雄性沙鼠，体质量为40～60 g，由遵义医科大学提供。单笼饲养，室温24～26℃，湿度50%，昼夜交替时长12 h，自由进食饮水。SPF 级普通维持饲料和定制高脂饲料（89%基础饲料+1% 胆固醇+l0% 猪油配方）购自广东省医学实验动物中心。戊巴比妥钠购自Sigma 公司；
苏木素、尹红购自索莱宝公司；
多聚甲醛购自天津大茂化学试剂厂；
其他试剂为国产分析纯。MASSON 染色试剂盒购自索莱宝公司；
组织TG、TC 检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；
BCA 蛋白检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验分组与造模 30 只体质量40～60 g 雄性沙鼠，随机分为正常对照组（NCG）和模型组（MG），每组15 只。正常对照组给予正常维持饲料喂养，模型组进行高脂饲料喂养，自由进食，单笼喂养，保持笼具清洁，分别喂养16 周。
1.2.2 沙鼠血脂和体质量检测 造模前两组沙鼠禁食不禁水16 h 后，2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔麻醉，用毛细玻璃管眼眶静脉丛取血，于1.5 mL 高压灭菌的离心管中室温静置1 h，室温4 500 r/min 离心10 min，分离血清，使用全自动生化分析仪通过质控，按标准化值标定后测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平。同时测定两组沙鼠造模前体质量。造模16 周后，按照上述方法检测血清TG、TC、LDL-c和HDL-c，同时检测造模后的体质量。
1.2.3 肝脏取材和肝体质量指数计算 戊巴比妥钠麻醉后，将沙鼠固定于小动物解剖台上，用剪刀快速剪开腹腔及胸腔。在解剖显微镜下仔细分别将肝脏、胃和胃连接的筋膜分离，剪断进出肝脏的动静脉，将肝脏取下。预冷PBS 溶液清洗后，放置于带有标尺的板上拍照并称重，计算肝体质量指数。肝体质量指数为肝脏湿重与体质量之比。之后将肝脏分成两部分，一部分用4% 多聚甲醛溶液固定，用于HE 染色和MASSON染色；
另一部分切成小块，在液氮中速冻10 s，置-80℃备用，用于测定肝脏TG 和TC 含量。
1.2.4 肝脏总TG、TC 含量测定 取-80℃冻存的部分肝脏，加入液氮研磨。按照1 mg 肝脏加入10 μL裂解液比例于冰上裂解10 min，2 000 r/min 离心5 min 后取适量上清，BCA 法测定蛋白含量。剩余上清 70 ℃加热10 min，2 000 r/min 离心5 min，取上清测定TG 和TC 含量。按4∶1 比例配置工作液，取4 mL试剂R1 与1 mL 试剂R2 混合。在96 孔板上，每组样品设3 个复孔，每孔加入190 μL 工作液和10 μL 样品上清液，轻摇混匀，于室温避光反应20 min，在酶标仪上550 nm 波长下进行比色。分别绘制TG 和TC 的标准曲线，计算TG 和TC 浓度，以每毫克蛋白浓度校正TG 和TC 的含量。
1.2.5 肝脏石蜡切片HE 染色和MASSON 染色 切取部分肝脏，在4%多聚甲醛中固定24 h 以上，经水洗、脱水、透明、恒温浸蜡之后在包埋机上进行包埋，以厚度为4 μm 进行切片。切片经脱蜡、脱二甲苯、水洗后参照染色试剂盒说明书进行HE 和MASSON 染色，最后封片。在显微镜下观察、拍照。
1.3 统计学处理
采用Grapad Prime 8.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 造模前后沙鼠血脂四项的改变
测定造模前两组沙鼠的血清TG、TC、LDL-c 和HDL-C 水平，差异均无明显变化（P＞0.05），结果见图1A。高脂饲料喂养16 周后，MG 沙鼠血清中TC、TG、LDL-c 和HDL-c 含量均明显高于NCG（P＜0.01 或0.05），见图1B。结果提示高脂喂养16 周后可导致沙鼠出现高脂血症。
图1 造模前后沙鼠的血脂4 项水平
2.2 沙鼠体质量与肝指数
高脂饲料喂养16 周后，MG 沙鼠体质量平均增加（46.17±5.77）g，高于NCG 沙鼠体质量的（20.80±3.70）g，两组差异有统计学意义（P＜0.01）。解剖沙鼠亦可发现，MG 沙鼠腹腔脂肪量较NCG 沙鼠明显增多。取完整肝脏，称取肝脏湿重，计算肝指数。结果显示，MG 沙鼠肝指数为0.074±0.003，明显高于NCG 的0.033±0.002（P＜0.01）。该结果提示高脂饮食可导致沙鼠体质量和肝脏重量增大。
2.3 沙鼠肝脏大体形态
造模16 周后取完整肝脏，可见MG 沙鼠肝脏外观呈浅黄色，有油腻感，肝脏弥漫性肿大，肝包膜紧张，切开肝脏，切缘外翻，肝缘变顿，呈肝脏脂肪异常累积现象。NCG 肝脏大小适中，呈红褐色，肝脏边缘锐利，切面整齐，见图2。结果说明，高脂饮食可导致沙鼠肝脏出现脂肪累积。
图2 造模16 周后沙鼠肝脏形态观察（cm）
2.4 肝脏总TG、TC 含量
肝脏充分研磨后，离心取上清测定肝脏总TG 和TC 含量。结果显示，高脂喂养16 周后，MG 组沙鼠肝脏中总TG 含量为(183.80 ± 5.69) μmol/g 蛋白，与正常对照组的(114.33 ±16.55) μmol/g 相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；
总TC 含量为(506.49 ± 47.87) μmol/g，亦高于正常对照组的(61.67 ± 6.68) μmol/g，差异有统计学意义(P＜0.01)。结果提示，高脂饮食16 周后，沙鼠摄入的大部分脂肪和胆固醇累积在肝脏。
2.5 沙鼠肝脏石蜡切片HE 染色
对肝脏进行石蜡包埋，切片进行HE 染色，结果见图3。HE 染色显示，NCG 沙鼠肝细胞形态正常，肝索肝窦结构清晰，胞质均匀淡染，细胞核居中。而MG 沙鼠切面分布大小不等空泡，肝细胞变大，细胞核偏向一侧，肝细胞拥挤，呈明显肝细胞脂肪变性征象。
图3 高脂喂养16 周后沙鼠肝脏HE 染色（200×）
2.6 沙鼠肝脏冰冻切片油红O 染色
为验证HE 切片空泡为异常累积的脂肪，取新鲜肝脏进行冰冻切片油红O 染色。结果显示，高脂喂养16 周后MG 沙鼠肝细胞内出现大量均质红染（图4），与石蜡切片HE 染色空泡位置一致，提示肝脏细胞脂肪累积。
图4 高脂喂养16 周后沙鼠肝脏油红O 染色（200×）
2.7 沙鼠肝脏石蜡切片MASSON 染色
在高脂沙鼠模型基础上，延长高脂喂养时间，对肝脏进行石蜡切片MASSON 染色。结果显示，与NCG沙鼠相比，MG 沙鼠的肝小叶结构出现紊乱，肝细胞有空泡、肝血窦周围出现纤维化，胶原纤维大量增生并形成纤维间隔，可见汇管区纤维化，偶见假小叶形成（图5）。
图5 高脂喂养16 周后沙鼠肝脏MASSON 染色（200×）
随着生活水平的提高、饮食习惯的改变，NAFLD的发病率逐年上升，人类的HF 的自然发生发展过程为：NAFLD-NASH-HF，即出现高脂血脂后，肝脏之后累积，形成NAFLD，肝细胞由于脂毒性出现炎症，导致NASH，炎症因子激活肝星状细胞，产生过量的细胞外基质导致HF。NAFLD 是一种由多重因素导致的肝脏脂肪异常累积，早期表现为肝细胞单纯性的脂肪累积，后期可发展为NASH、HF，肝脏纤维化可导致肝小叶形态紊乱，胆汁淤积，如不进行有效干预，最终可发展成肝硬化和肝细胞癌[12]。
外源性的脂类物质，被转运到肝脏，被肝细胞摄取进行代谢[13]，当机体需要脂类物质时，肝细胞内的脂类物质可通过极低密度脂蛋白运输到外周，保持肝细胞中的脂类物质处于合理水平，当摄入过多的脂类物质时，其累积在肝细胞中，出现肝细胞脂肪变[14-15]，实验结果显示，高脂喂养16 周时，MG 组沙鼠血清中TC 含量、TG 及LDL-c 含量均高于NCG 组沙鼠水平（P＜0.01），提示MG 组沙鼠出现高脂血症。血液中的TC、TG 被运输到肝细胞中代谢，过多的TG、TC 被累积于肝细胞，导致肝脏肿大，16 周时取完整沙鼠肝脏，大体观显示肝脏体质量增大，肝包膜紧张，称取肝脏湿重和体质量计算肝指数亦提示MG 组沙鼠肝指数高于NCG 组。为验证是否增大的肝脏是因为TG、TC 累积所致，进一步去肝组织研磨，检测肝组织中总TG 和TC含量，结果显示MG 沙鼠肝脏TG 和TC 含量明显高于NCG 沙鼠（P＜0.05 或0.01），提示高脂喂养可导致沙鼠肝脏TG 和TC 异常累积，符合NAFLD 发病机制。肝脏中过度累积的TG 在代谢过程中会产生有毒物质，导致内质网应激和炎症介质激活，这些因素共同引起肝细胞损伤出现NASH[16]。肝脏在持续炎症介质的刺激下，肝窦内处于静止状态下的星状细胞可被激活，转分化为促瘢痕形成的肌成纤维细胞，分泌大量的细胞外基质对肝损进行修复，但过量的细胞外基质可导致肝脏出现纤维化，破坏肝小叶的正常形态，导致肝硬化甚至肝细胞癌变[17]。肝脏组织病理检查是诊断HF 的金标准，16 周时MG 沙鼠肝脏进行石蜡切片HE 和油红O 染色，均表现出肝脏脂肪累积，符合NAFLD 的诊断标准，成功构建单纯高脂饮食诱导的NAFLD 动物模型。在此基础上进行MASSON 染色，结果显示16周时MG 沙鼠肝脏出现纤维化，符合HF 诊断标准。
本实验方法通过单纯的高脂喂养，模拟人类因饮食习惯改变导致的高脂血症，肝脏脂肪累积出现NAFLD，在没有有效的干预措施前提下，继续高脂饮食，导致NASH，炎症介质激活肝脏星状细胞，分泌大量的细胞外基质，最终导致HF 发生。该模型与人类HF 的发生发展模式相似，且造模方法简单，且可在不同时间点取材观察到HF 发生发展全过程，沙鼠体型居中，成年沙鼠100 g 左右，方便操作和多次取血，优于大小鼠，有利于对HF 发病机制的研究。
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