符德静，易红，郭凤倩，高慧敏，李春，闫利华，王萍，斯琴，刘晓谦*，王智民*
1.广东药科大学，广东 广州 510006；
2.中国中医科学院 中药研究所/中药质量控制技术国家工程实验室，北京 100700
延龄草Trillium tschonoskiiMaxim.又名头顶一颗珠、芋儿七、狮儿七等，为百合科延龄草属植物，是著名的恩施土家族四大神药之一[1]，也是陕西“太白七药”之一[2]。延龄草以干燥根及根茎入药，其味甘，性平，有小毒，具有镇静安神、活血止血、消炎镇痛、解毒等功效，主治头晕目眩、跌打损伤、神经衰弱、高血压和脑震荡后遗症等[3-6]。延龄草中含有多种有效成分，如甾体皂苷、倍半萜苷、黄酮、多糖等[7-8]。近年来关注最多是其甾体皂苷类成分，包括偏诺皂苷、薯蓣皂苷及延龄草烯苷等[9-11]，其中重楼皂苷Ⅶ、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（PRRG）和重楼皂苷Ⅵ均属于偏诺皂苷，且是其中含量较高的成分。现代药理学研究表明，偏诺皂苷具有止血[12]、镇痛抗炎[13]、抗菌[14]、抗肿瘤[15]等作用，具有明确的药用价值。因此，本研究旨在从延龄草中富集3 个主要偏诺皂苷获得总皂苷，为延龄草总皂苷有效部位深入的药效评价服务。
1.1 仪器
Ultimate 3000 型高效液相色谱仪、Multiskan Go 型酶标仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；
N-1100 型EYELA 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；
HEP-100×60 型颚式破碎机（鹤壁市银河分析仪器化工有限公司）；
DET-50 型高速万能粉碎机（温岭市大德中药机械有限公司）；
BT125D 型十万分之一电子天平、BSA224S-CW 型万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；
98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）、JULABO SW22 型恒温水浴振荡器（优莱博技术有限公司）；
HWSY21-KP6 型电热恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司）；
DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱（杭州艾普仪器设备有限公司）；
L530 型医用离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；
LDZX-50L-I型立式高压蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂）；
3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo 公司）；
CKX41 型光学倒置显微镜（Olympus 公司）；
MB100-2A 型微孔板恒温振荡器（杭州奥盛仪器有限公司）。
1.2 试药
对照品重楼皂苷Ⅶ（P1，批号：DSTDC003001，纯度≥98%）、PRRG（P2，批号：DSTDP005701，纯度≥98%）、重楼皂苷Ⅵ（P3，批号：DSTDC002901，纯度≥98%）均购自四川成都德思特生物科技有限公司；
色谱甲醇、乙腈（美国Fisher 公司）；
95%乙醇（国药集团化学试剂有限公司）；
HPD300、HPD400、HPD600 型大孔吸附树脂（河北沧州宝恩吸附材料有限公司）；
SP825l、SP700、SP70 大孔吸附树脂（日本三菱化学公司）；
水为娃哈哈纯净水；
其他试剂均为分析纯；
一氧化氮（NO）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；
胎牛血清（批号：2168090RP）、磷酸盐缓冲液（PBS，批号：02221008）、DMEM 高糖培养基（批号：8121475）、0.25%胰蛋白酶（批号：2276965）均购自美国Gibco 公司；
脂多糖（LPS，批号：L2880，美国Sigma 公司）；
噻唑蓝（MTT，北京京汇科技有限公司）；
二甲基亚砜（DMSO，上海麦克林生化科技有限公司）；
HyClone SV30010 青链霉素（双抗）混合液（美国Cytiva公司）。
延龄草药材购自湖北巴东一零八药材种植专业合作社，经中国科学院昆明植物所李恒研究员鉴定为百合科延龄草属植物延龄草Trillium tschonoskiiMaxim.的干燥根及根茎。
1.3 细胞
小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7 购自中国科学院上海细胞库。
2.1 延龄草总皂苷的含量测定方法建立
2.1.1 色谱条件 参考文献[16]方法对其色谱条件适当微调，调整后的方法：Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～26 min，30%～40%A；
26～45 min，40%～41%A）；
检测波长：203 nm；
柱温：30 ℃；
流速：1.0 mL·min-1。高效液相色谱法（HPLC）图谱见图1。
图1 重楼皂苷Ⅶ、PRRG、重楼皂苷Ⅵ混合对照品和延龄草样品的HPLC图
2.1.2 对照品溶液的制备 称取重楼皂苷Ⅶ、PRRG、重楼皂苷Ⅵ对照品适量[17]，精密称定，加甲醇配置成质量浓度分别为0.098 4、0.587 0、0.829 0 mg·mL-1的混合对照品溶液，备用。
2.1.3 供试品溶液的制备 药材含量测定用样品：称取延龄草根茎粉末（过50 目筛）0.5 g，精密称定，置50 mL 锥形瓶中，加入乙醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。经测定所收集的延龄草药材的总皂苷的质量分数以3个皂苷质量分数之和计为4.97%。总皂苷提取物样品：称取延龄草总皂苷提取物粉末（过80目筛）15 mg，精密称定，甲醇定容至10 mL 即得延龄草总皂苷提取物供试品溶液。
2.1.4 线性关系考察 取2.1.2 项下混合对照品溶液，用甲醇分别稀释1、2、10、12.5、20、25倍，配制成系列质量浓度的混合对照品进样，以对照品质量浓度为横坐标（X）与峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。得到重楼皂苷Ⅶ、PRRG、重楼皂苷Ⅵ的线性回归方程：YP1=45.358 0X+0.010 4（r=0.999 9）、YP2=55.466 0X+0.018 4（r=1.000 0）、YP3=65.624 0X+0.004 1（r=1.000 0），重楼皂苷Ⅶ、PRRG、重楼皂苷Ⅵ分别在0.004 0～0.098 4、0.023 0～0.587 0、0.033 0～0.829 0 mg·mL-1与峰面积线性关系良好。
2.2 数据处理
利用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 7 软件对数据进行统计分析，实验数据以（）表示，采用单因素方差分析和双侧t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。
2.3 提取工艺
2.3.1 提取溶剂的单因素考察 对提取溶剂进行单因素考察，选取50%、75%、95%乙醇为提取溶剂，料液比1∶10，提取1 h。提取溶剂为50%乙醇、75% 乙醇、95% 乙醇的提取率分别为（80.81±0.88）%、（88.25±1.47）%、（85.31±0.44）%，结果表明75%乙醇提取效果最佳。
2.3.2 正交试验设计 根据文献[18]及单因素考察结果，确定提取溶剂为75%乙醇，选取液料比（A）、提取时间（B）、提取次数（C）作为提取工艺的考察因素，以延龄草总皂苷提取率为考察指标。称取延龄草药材（过50 目筛）9 份，每份20 g。因素水平及结果见表1～3。由结果可知，对延龄草总皂苷提取率影响顺序为C＞A＞B。因素A 和因素B 为不显著因素，因素C 各水平对延龄草总皂苷的提取率影响差异有统计学意义（P＜0.05）。综合以上结果，正交试验所得的最优工艺为A3B2C3，即75%乙醇，液料比为12∶1，提取3 次，每次90 min。考虑液料比对提取率影响不大，从节约溶剂的角度，调整液料比为10∶1；
随着提取次数的增加，提取率逐渐增大，但提取2次和提取3次时延龄草总皂苷提取率增加不明显，且提取次数的增加会导致能耗增加，故将提取次数调整为2 次，即最优工艺为以75%乙醇为提取溶剂，按液料比10∶1 加入提取溶剂，加热回流提取2次，每次1.5 h。
表1 延龄草总皂苷提取工艺正交试验因素水平
2.3.3 验证实验 按优选的最佳提取工艺进3 批验证实验，延龄草总皂苷提取率分别为88.57%、87.72%、89.44%，均值为88.58%，3 批结果较为一致，表明此工艺条件稳定可行。
2.4 大孔树脂纯化富集工艺
2.4.1 提取液的制备 取延龄草根茎粉末100 g，按最佳工艺进行提取，合并滤液，减压浓缩至无醇味，生药质量浓度为0.1 g·mL-1即为延龄草提取液。
2.4.2 大孔树脂型号筛选 称取经预处理后各型号（HPD300、HPD400、HPD600、SP70、SP700、SP825l）大孔吸附树脂各2 g，置100 mL具塞锥形瓶中，分别加入延龄草提取液50 mL（挥至无醇味后，加水定容至药液质量浓度为0.1 g·mL-1），于恒温水浴振荡器（25 ℃、120 r·min-1）中持续振荡24 h 使其达到吸附平衡，滤过，取滤液定容至100 mL，得吸附后的溶液，测定溶液中3个主要皂苷的含量，计算得到各型号树脂的静态吸附量和吸附率。将达到饱和吸附的各型号树脂滤出后分别另置100 mL 锥形瓶中，各加入95%乙醇50 mL，在相同条件下恒温振荡24 h，进行解吸附，滤过，滤液定容至100 mL，得解吸后的溶液，测定延龄草总皂苷含量，计算各型号树脂的解吸率和转移率，结果见表4。综合各型号树脂的静态吸附数据，以转移率［按公式（1）计算］为综合评分指标，SP700和HPD400型树脂转移率均较高，鉴于树脂价格考量，选择HPD400 型树脂进行纯化。
特殊地，当部件任务ti,,tk可并行执行时，将其视为一个虚拟任务tg，tg=ti∪∪tk。根据式(24)和定义2，若数据快照为tg对应的信息，则将任务对应的物料、工艺、质量节点关联起来，有
表2 延龄草总皂苷提取工艺正交试验设计结果
表3 延龄草总皂苷提取工艺正交试验方差分析结果
表4 各型号树脂延龄草皂苷的静态吸附率、解吸率及转移率结果 %
2.4.3 上样量和上样流速的考察 量取5 份经预处理的HPD400 型大孔树脂30 mL，分别装于5 根色谱柱（内径1.5 cm，高35 cm，树脂径高比约1∶10）中，分别以1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 BV·h-1流速进行上样，分段收集流出液，每个柱体积为1 个流分，共收集10 BV，测定各上样流出液中延龄草总皂苷的含量，并绘制泄漏曲线。由图2可知，以1 BV·h-1流速上样总皂苷泄漏点出现最晚，表明其吸附量最多，因此选择1 BV·h-1为上样流速。此时上样体积为5 BV时，即折合生药量15 g时开始出现泄漏，说明树脂已经达到吸附饱和，因此最大上样量定为药材-树脂（1∶2），药液质量浓度为0.1 g·mL-1。
图2 延龄草总皂苷泄漏曲线
2.4.4 洗脱溶剂的考察 取HPD400 型大孔树脂30 mL，装于色谱柱中，以1 BV·h-1流速进行上样，上样量为150 mL 药液［质量浓度为0.1 g·mL-1（生药）］。上样吸附完成后，依次用水、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱溶剂用量均为3 BV，再分别用6 BV 的50%、60%、70%、95%乙醇进行梯度洗脱，收集洗脱液。每个柱体积为1 个流分，测定各流分中延龄草总皂苷的含量及浸膏含量。由图3 结果可知，总皂苷主要集中在50%～70%乙醇洗脱部位，3 个部位总皂苷洗脱率之和达90%以上，由表5 可知，以50%乙醇及60%乙醇部位含量较高，为保证总皂苷收率，最终纯化工艺定为上样完毕后，以20%乙醇洗脱除去杂质，再用70%乙醇洗脱，收集洗脱液。
表5 各洗脱部位延龄草总皂苷质量分数及浸膏量
图3 各洗脱部位延龄草总皂苷的洗脱率变化
2.4.5 洗脱流速和洗脱体积的考察 量取3份HPD400型大孔树脂30 mL，装于色谱柱中，以1 BV·h-1流速进行上样，上样量为生药（g）∶树脂（mL）为1∶2。上样吸附完成后，用3 BV 的20%乙醇洗脱，除去杂质，收集70%乙醇洗脱部位，共收集10 BV，洗脱流速分别为1、2、3 BV·h-1流速，分段收集洗脱液，每1 BV（30 mL）为1 个流分，共收集10 份，测定各流分中延龄草总皂苷的含量，计算洗脱率。由图4 可知，当洗脱溶剂用量达5 BV 时各组样品的总皂苷均基本洗脱完全，因此洗脱剂用量定为5 BV。为节约时间和提高洗脱效率，洗脱流速定为3 BV·h-1。
图4 不同流速下延龄草各流分的洗脱率变化
2.4.6 验证实验及中试放大试验 按优化的纯化工艺进行放大10 倍验证实验，延龄草总皂苷的质量分数为35.16%，收率为8.04%，说明该纯化工艺稳定可行。开展了50 kg级的中试放大试验，结果与验证实验的结果基本一致，20%乙醇洗脱部位几乎不含皂苷成分，说明能够将有效部位保留且除掉其他杂质；
70%乙醇洗脱部位延龄草总皂苷的质量分数为34.29%，收率为7.42%。逐级放大实验的结果与实验室工艺一致，表明工艺具备放大的可行性，方法稳定、可控。
2.5 延龄草总皂苷提取物的抗炎活性
2.5.1 样品的制备 取延龄草醇提物（CT，收率为38.10%，总皂苷质量分数为10.10%）及树脂纯化物（CH，收率为7.42%，总皂苷质量分数为34.29%），分别精密称取上述2 种提取物适量，用DMSO 溶解，配制成质量浓度为100 mg·mL-1的储备液，于冰箱4 ℃保存（实验时用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM 培养液稀释成不同的质量浓度，DMSO终体积分数不超过0.1%）。
2.5.2 MTT 法检测细胞活性 取对数生长期的RAW264.7 细胞，按细胞密度1×105个/mL，每孔100 μL 接种于96孔板中，分为空白组和实验组，于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，实验组加入用完全培养基配制好的不同质量浓度（50.00、25.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.10、0.05 μg·mL-1）的CH和CT药液10 μL，每个质量浓度设置3个复孔，对照组加入等体积完全培养基，随后置于培养箱中培养24 h。给药孵育后，每孔中加入MTT 10 μL（避光加入），置于培养箱中孵育4 h，吸弃孔内培养基，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min 溶解结晶，置于酶标仪中，在570 nm 波长[19-21]下测定吸光度（A）值，按公式（2）计算细胞存活率。
细胞存活率＞90%可认为无细胞毒性，图5 结果表明，CT 组在25.00～0.05 μg·mL-1与细胞共培养24 h 无明显毒性，CH 组在5.00～0.05 μg·mL-1与细胞共培养24 h 无明显毒性，因此两组可分别在无细胞毒性的质量浓度下进行后续实验研究。
图5 延龄草CH和CT对RAW264.7细胞活力的影响（,n=3）
由图6可知，与空白组相比，LPS模型组能显著增加NO的释放量，说明LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型制备成功。与LPS模型组相比，CT组仅在25 μg·mL-1的质量浓度下对NO的释放表现出明显的抑制作用（P＜0.000 1）；
CH组在5.00、1.00 μg·mL-1的质量浓度下均对NO 的分泌有显著的抑制作用（P＜0.000 1，P＜0.05）。延龄草CT 得率为38.10%，延龄草CH 得率为7.42%，说明经树脂纯化后，其抗炎效果明显提升。
图6 延龄草CH和CT对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响（, n=5）
LPS 诱导RAW264.7 细胞产生多种炎症细胞因子，是经典的筛选抗炎药物的炎症模型，被广泛用于药物体外抗炎研究。NO是各种炎症介质之一，参与介导细胞免疫和炎症毒性反应，在调节多种生理功能方面起重要作用，如扩张血管、神经传递和炎症应答等。以LPS激活RAW264.7巨噬细胞炎症信号通路，在细胞培养液中释放产生大量NO，加剧炎症反应，此时通过药物进行干预，NO浓度的变化可以用来评价药物抑制炎症反应的强弱。CH和CT均可抑制LPS诱导的NO 的释放，在1.00～5.00 μg·mL-1药物质量浓度，CH组的抑制作用呈剂量依赖性，可显著抑制NO 的释放，其IC50值为3.79 μg·mL-1，而CT 组的IC50值为20.68 μg·mL-1，其效果与纯化前相比明显提升。
在树脂纯化工艺优化过程中，考虑到70%洗脱部位总皂苷含量仍偏低，曾尝试将除杂溶剂的乙醇体积分数提高至30%，但70%洗脱部位总皂苷含量并未提高，且收率反而明显下降，故仍选择了20%乙醇洗脱杂质。
本研究对优化的提取、纯化工艺进行了逐级放大工艺验证，证明了工艺的稳定性、可靠性，经提取、纯化得到的延龄草总皂苷纯度较高，工艺稳定、可控。
延龄草中的偏诺皂苷含量远高于其同属植物重楼[22-23]，两者在传统应用习惯中也较为相似，相比重楼，延龄草作为一种量大、易得的药材具有更为广阔的发展前景。本研究基于延龄草皂苷确切的抗炎活性，开展适合于工业化生产的延龄草抗炎有效部位的提取、纯化工艺研究，为推动延龄草的发展提供支撑。
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