劳艳萍，姚妮，唐秀法，公方强，黄华，牛向丽
(广西壮族自治区生殖医院，南宁 530000)
出生性别比(Sex ratio at birth，SRB)的平衡对于维持社会稳定、促进经济发展具有重要意义，性别比例的严重失衡可能引发一系列社会问题。SRB以每出生100个女婴对应出生男婴数表示。第一性别比(Primary sex ratio，PSR)是指怀孕时的男女性别比例。有数据表明，自然妊娠的PSR为107～170∶100[1]，其会因为自然流产或性别选择等因素显著降低。SRB是监测人口生殖健康简单又无创的一种方式[2]。传统的自然妊娠男女婴儿的出生比例为106～110.2∶100[3]。我国不孕不育发病率呈逐年上升的趋势，2007年我国的不孕率约为12%，2010年不孕率上升至15%，2020年不孕率上升至18%左右。辅助生殖技术(ART)帮助很多不孕症患者实现成功受孕，我国每年ART总周期数在100万以上，出生婴儿数超过30万[4]。随着大量试管婴儿的出生，会不会影响SRB？引起性别比例失衡？以上这些问题都有待验证。因此，本研究回顾性分析2010年1月至2019年12月在我院行体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治疗并成功妊娠分娩共19 844个周期患者的临床资料，排除由患者个人因素如年龄、男方体质量指数(BMI)、女方BMI、不孕类型、职业等因素造成SRB改变的干扰因素，单纯从实验室因素(受精方式、移植胚胎类型、移植胚胎时期和移植胚胎数)分析ART对子代SRB的影响。
一、研究对象
回顾性分析2010年1月至2019年12月在我院行IVF/ICSI-ET并成功妊娠分娩的共19 844个周期患者的临床资料。
纳入标准：在电子病例系统中明确含有受精方式、移植胚胎类型、移植胚胎时期和移植胚胎数信息；
移植<3枚胚胎；
获得成功妊娠并分娩。
排除标准：受精方式、移植胚胎类型、移植胚胎时期和移植胚胎数其中任一项信息不明确。
二、研究方法
1.分组：由于受精方式、移植胚胎类型、移植胚胎时期和移植胚胎数目等是ART的主要实验室因素，因此，根据不同受精方式分为IVF组(n=14 626)和ICSI组(n=4 908)(剔除行补救ICSI的310个周期)；
根据不同移植胚胎时期分为卵裂胚组(n=8 778)和囊胚组(n=11 066)；
根据不同移植胚胎类型分为新鲜胚胎组(n=11 533)和解冻胚胎组(n=8 311)；
根据不同移植胚胎个数分为单胚胎组(移植1枚胚胎，n=3 871)和双胚胎组(移植两枚胚胎，n=14 483)(剔除移植≥3枚胚胎的1 490个周期)。
2.促排卵方案：依据患者情况采用长方案、短方案、超长方案、微刺激方案、拮抗剂方案、自然周期等促排卵方案，均按照常规操作进行[5]。
3.胚胎冷冻和解冻复苏：行胚胎冷冻者采用玻璃化冷冻及解冻复苏[6]；
使用玻璃化冷冻解冻试剂盒(KITAZATO，加藤，日本)，早上解冻，当天中午或者下午移植。
4.胚胎质量评价：D3胚胎移植一般选择优质胚胎，如无优质胚胎，则在患者知情同意的情况下选择非优质胚胎移植。采用Peter评分法[7]对卵裂期胚胎进行评分；
正常受精胚胎中评1～2级、6细胞及6细胞以上的胚胎和提前进入融合期的胚胎为优质胚胎。囊胚评级采用Gardner评分法[8]，根据囊胚腔大小和是否孵出分为1～6期，根据内细胞团和滋养层细胞数目分为A、B、C三级；
优先移植3期及以上非CC级囊胚，若无3期及以上囊胚，可移植1、2期囊胚。
5. 胚胎移植：<35岁患者第1次移植周期移植2枚卵裂期胚胎或1枚囊胚，若无优质囊胚形成可移植2枚囊胚；
如第1次移植未孕，再次移植时可移植2枚胚胎。≥35岁患者可移植2枚胚胎。患者有剖宫产史或子宫肌壁间肌瘤剔除术后且年龄<40岁，第1、2次移植建议移植1枚胚胎，若无优质胚胎则告知多胎妊娠风险并签字后可移植2枚胚胎；
移植2次优胚均未孕时，告知多胎妊娠风险并签字后可移植2枚胚胎；
年龄≥40岁患者，告知多胎妊娠风险并签字后可移植2枚胚胎。
三、统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计学分析。计数资料用率(%)表示，组间比较采用卡方检验；
采用单因素以及多因素Logistic回归分析各因素与SRB的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
一、IVF/ICSI-ET总体新生儿的SRB情况
我院2010年1月至2019年12月行IVF/ICSI-ET出生的新生儿共24 661名，其中男婴占54.9%(13 532/24 661)，女婴占45.1%(11 129/24 661)，该时期ART的SRB(121.6∶100)高于文献报道的自然受孕的SRB(106～110.2∶100)。新鲜胚胎移植出生的男婴为7 941名，女婴6 655名，新鲜胚胎移植出生的新生儿占ART出生总新生儿的59.2%(14 596/24 661)；
解冻胚胎移植出生的男婴5 591名，女婴4 474名，解冻胚胎移植出生的婴儿占比为40.8%(10 065/24 661)。除去补救ICSI出生的婴儿，行IVF出生的男婴为10 172名，女婴为8 059名，行IVF出生的新生儿占比为73.9%(18 231/24 661)；
行ICSI出生的男婴为3 135名，女婴为2 915名，行ICSI出生的新生儿占比为24.5%(6 050/24 661)。移植卵裂胚出生的男婴为5 829名，女婴为5 168名，移植卵裂胚出生的新生儿占比为44.6%(10 997/24 661)；
移植囊胚出生的男婴为7 703名，女婴为5 961名，移植囊胚出生的新生儿占比为55.4%(13 664/24 661)。单胚胎移植出生的男婴为2 229名，女婴为1 715名，单胚胎移植出生的新生儿占比为16.0%(3 944/24 661)；
双胚胎移植出生的男婴为10 264名，女婴为8 519名，双胚胎移植出生的新生儿占比为76.2%(18 783/24 661)。
二、IVF/ICSI-ET中不同实验室因素对SRB的影响
IVF/ICSI-ET的实验室因素包括：受精方式、移植胚胎类型、移植胚胎时期和移植胚胎数。
1.受精方式对SRB的影响：根据不同受精方式分为IVF组(n=14 626)和ICSI组(n=4 908)。IVF组共出生10 172名男婴，8 059名女婴，SRB为126.2∶100；
ICSI组共出生3 135名男婴，2 915名女婴，SRB为107.5∶100；
IVF组SRB显著高于ICSI组(P<0.05)。对这两组患者根据移植胚胎时期和胚胎类型进行亚组分层，在相同移植时期或相同胚胎类型的分层中，IVF组SRB均显著高于ICSI组(P<0.05)(表1)。
表1 不同受精方式对SRB的影响(%)
2.移植胚胎时期对SRB的影响：根据不同移植胚胎时期分为卵裂胚组(n=8 778)和囊胚组(n=11 066)。卵裂胚组的SRB(112.8∶100)显著低于囊胚组(129.2∶100)(P<0.05)。对这两组患者根据不同受精方式和胚胎类型进行亚组分层，在相同受精方式或胚胎类型的分层中，囊胚组的SRB均显著高于卵裂期组(P<0.05)(表2)。
表2 不同移植胚胎时期对SRB的影响(%)
3.移植胚胎类型对SRB的影响：根据不同移植胚胎类型分为新鲜胚胎组(n=11 533)和解冻胚胎组(n=8 311)。新鲜胚胎组的SRB为119.3∶100，解冻胚胎组的SRB为125.0∶100，解冻胚胎组的SRB略高于新鲜胚胎组，但差异尚无统计学意义(P>0.05)(表3)。
表3 不同移植胚胎类型对SRB的影响(%)
4.移植胚胎数对SRB的影响：根据不同移植胚胎数分为单胚胎组(n=3 871)和双胚胎组(n=14 483)。单胚胎组的SRB(130.0∶100)显著高于双胚胎组(120.5∶100)(P<0.05)；
但是，根据不同移植时期进行亚组分层比较时，两组间SRB未表现出显著性差异(P>0.05)(表4)。
表4 不同移植胚胎数对SRB的影响(%)
三、单因素和多因素Logistic回归分析不同影响因素和SRB的相关性
单因素和多因素Logistic回归分析发现，受精方式[OR=0.854，95%CI(0.803，0.908)]和移植胚胎时期[OR=1.192，95%CI(1.114，1.276)]是SRB的独立影响因素(P<0.001)(表5)。
表5 单因素和多因素Logistic回归分析不同影响因素与SRB的相关性
四、2010～2019年我院总SRB变化趋势
2010～2019年我院IVF/ICSI-ET周期出生新生儿的总SRB变化趋势如下：SRB没有明显逐年升高或者降低的趋势；
在相同年份中，卵裂胚的SRB相对于囊胚有降低的趋势，ICSI的SRB相对于IVF有降低的趋势(表6)。
表6 2010～2019年我院总SRB变化趋势
从全国人口第7次普查数据得知，男性人口为72 334万人，占51.24%(72 334/141 178)；
女性人口68 844万人，占48.76%(68 844/141 178)，全国总人口性别比为105.07∶100[9]。性别比偏高的直接原因就是SRB偏高，受到曾经重男轻女思想的影响，SRB曾一路攀高，2000年曾经达到118.6∶100，2010年也停留在118.1∶100，个别省份个别年份的性别比甚至高达125∶100甚至130∶100以上。在针对SRB偏高的干预措施下，2010年后我国SRB开始明显下降，2020年降到111.3∶100[10]。目前，总人口中男性比女性多3 490万，造成的婚姻挤压是客观存在的，SRB失衡会影响经济发展和社会和谐。许多生物因素、环境因素会影响自然受孕的SRB，父母年龄较大、母亲体重较高、高压力(社会因素、战争、地震、经济困境)和有害物质接触(吸烟、污染物、杀虫剂)等会降低SRB[11-12]。此外，在正常的人类发育过程中，有一种性别偏向的死亡率趋势，孕期女性胎儿的死亡率总体较高，这被认为是由于母体遗传的mRNA或胚胎合成的RNA表达中断所致[13]。另一种理论是，父亲的X染色体在一定程度上阻碍了发育，从而增加了女性胎儿死亡率[14]。这两种理论说明了孕期女性胎儿死亡率的升高会导致SRB升高。
本研究发现，IVF/ICSI-ET总体新生儿SRB为121.6∶100，稍高于我国2010年的SRB 118.1∶100，高于之前文献报道的自然妊娠SRB(106～110.2∶100)[3]。南方医科大学南方医院妇产科生殖中心2008～2014年ART出生婴儿的SRB为116∶100[15]。广州医科大学附属第三医院2013～2014年ART的平均SRB为118∶100[16]。由以推测，ART相比于自然妊娠可能会增加男婴的出生比。
以往诸多研究发现，IVF较ICSI会增加男婴出生比[1，12，15，17]。本研究结果发现，行IVF受精出生的新生儿SRB为126.2∶100，高于传统自然妊娠SRB(106～110.2∶100)。张力佳等[15]和王丽等[18]研究报道，行IVF受精出生的新生儿SRB分别为124∶100和128∶100，与我中心的数据相近。本研究结果发现，行ICSI出生的新生儿SRB(107.5∶100)与自然妊娠SRB相近。李磊等[16]研究发现，行ICSI受精出生的新生儿SRB为105∶100，我中心数据与之相近。根据移植胚胎时期或胚胎类型进行亚组分析，在相同移植胚胎时期或胚胎类型的分层中，IVF组SRB显著高于ICSI组(P<0.05)。Logistic回归分析发现，受精方式[OR=0.854，95%CI(0.803，0.908)]可能是SRB的独立影响因素。Supramaniam等[1]统计分析英国1 376 454个治疗周期得出，IVF相比于ICSI会增加16%的男婴出生；
受精方式对SRB的影响在调整女性年龄、移植胚胎时期后仍有统计学意义。Bu等[12]分析了中国18个生殖中心共121 247名新生婴儿，IVF组的SRB显著高于ICSI组(P<0.05)。
Tarín等[19]的一项Meta分析结果显示，IVF受精的PSR在129～150∶100之间，ICSI受精的PSR为107∶100。男性射精时含有相同比例的X、Y精子[20]，然而IVF在受精后雄性胚胎比例远远高于雌性胚胎。受精方式的差异主要是对X和Y精子的选择倾向性不同造成的。有学者认为，ICSI主要取决于操作者，一般选择ICSI的大多是由于男方因素导致的不育，Y精子形态异常多，操作者倾向于找形态正常的精子，因此X精子更容易被选中[16]。而行IVF时，男性胚胎在受精后可能比女性胚胎有发育优势，透明带的分子组成可能使卵母细胞更容易被携带Y染色体的精子受精，Y精子可能具有较高的受精能力[20]。有研究发现，密度梯度法有利于Y精子的富集，增加Y精子的比例，因此，密度梯度法会增加男婴的出生[21]。普通的ICSI(非手术取精)和IVF都会用到密度梯度法处理，手术取精的ICSI采用直接离心法处理。为了区分精液处理方法的不同，李磊等[16]将ICSI分为普通ICSI和经皮附睾、睾丸穿刺取精术结合ICSI技术(PESA/TESA-ICSI)，普通ICSI的SRB(113∶100)与IVF的SRB(121∶100)比较无显著差异(P>0.05)，PESA/TESA-ICSI的SRB(92∶100)显著低于IVF的SRB(121∶100)(P<0.05)，提示精子的优选方法对SRB影响较大。
以往的研究证明，囊胚移植会增加ART中男婴的出生比例[17，19，22-23]。本研究结果显示，移植囊胚的新生儿SRB(129.2∶100)显著高于卵裂胚移植的新生儿(112.8∶100)(P<0.05)。Chang等[24]的一项Meta分析结果显示，囊胚移植出生男婴是卵裂期胚胎移植的1.29倍，本研究结果与之相似。Logistic回归分析发现，移植胚胎时期[OR=1.192，95%CI(1.114，1.276)]可能是SRB的独立影响因素(P<0.001)。丁锦丽等[25]的Meta分析结果显示，囊胚移植组的SRB显著高于卵裂期胚胎移植组，且不受时间和地域的影响(P<0.001)。以往很多研究移植囊胚的SRB与自然妊娠相比偏高，李磊等[16]研究发现，囊胚移植组的SRB为138∶100，IVF囊胚移植组的SRB为146∶100。田莉峰等[23]研究报道，解冻囊胚移植的SRB为142∶100。刘帅等[26]研究发现，解冻IVF囊胚移植的SRB为142.6∶100。以上结果表明，囊胚移植对性别平衡的影响值得引起重视。
囊胚移植SRB偏高的原因可能有以下几点：首先，在人类胚胎早期发育中男性胚胎的发育速度明显高于女性胚胎，自受精后第2天开始，男性胚胎发育速度较女性胚胎至少提前4.5 h且获得最高形态学评分的胚胎中72%为男性胚胎[27-28]。在挑选胚胎移植时，通常选择发育良好、形态符合移植标准的胚胎进行移植，因此，男性胚胎被选为优质囊胚进行移植的概率很大[29-30]。Gutiérrez-Adán等[31]研究发现，X染色体上存在6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)和抗氧化酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，这两个基因可以调控糖代谢和氧化应激，女性胚胎比男性胚胎多1条X染色体，G6PD的双倍效应使得女性胚胎需要摄取更多的葡萄糖；
HPRT的双倍效应则使女性胚胎中更多的氧自由基被清除，过多的氧自由基对细胞有伤害作用，但适量的氧自由基则有利于细胞的生长。因此，G6PD和HPRT的双倍效应不利于女性胚胎应对体外培养环境的压力，最终导致其生长速度要慢于男性胚胎[29]。其次，由于男性胚胎比女性胚胎能更快地吸收丙酮酸和葡萄糖，从而更快地实现囊胚期的发育[22]。再者，囊胚移植后出现更高的继发性性别比例可能是由于植入后早期女性胚胎优先死亡所致，至少部分是由于两条X染色体中的1条异常失活(剂量补偿机制)导致[32]；
另外，Gutiérrez-Adán等[31]研究发现，与IVF比较，ICSI操作过程可致女性胚胎X染色体更早失活，从而使ICSI组女性胚胎体外培养时发育滞后的现象不明显。
本研究结果发现，解冻胚胎移植的SRB(125.0∶100)略高于新鲜移植(119.3∶100)，但差异无统计学意义(P>0.05)。Logistic回归分析发现，移植胚胎类型对SRB无显著影响。Bu等[12]研究发现，解冻胚胎移植可以提高SRB，但Logistic回归分析显示解冻胚胎移植与SRB无显著相关性，这可能与国内大多数中心在解冻周期多采用囊胚移植，而囊胚移植是出生婴儿性别比的独立影响因素有关。有研究发现，解冻胚胎移植会增加女婴的出生比例，分析原因可能与挑选移植和冷冻胚胎的标准有关，选择形态、发育好的胚胎作为新鲜移植的标准，而冷冻发育相对较差的胚胎或囊胚[33-34]。本研究中的新鲜囊胚移植占29.2%(4 265/14 596)，解冻囊胚移植占93.3%(9 399/10 065)，本中心新鲜移植以卵裂胚为主，解冻移植以囊胚为主，因此解冻移植的SRB略高于新鲜移植，但差异无统计学意义(P>0.05)。不同胚胎类型对SRB的影响跟每个中心的移植策略有关，移植囊胚越多其SRB值就会升高。
本研究结果显示，单胚胎移植的SRB显著高于双胚胎移植(P<0.05)。但是，Logistic回归分析显示，移植胚胎数与SRB无显著相关性。单胚胎移植中囊胚移植占85.6%(3 376/3 944)，双胚胎移植中囊胚移植占54.7%(10 280/18 783)，而囊胚移植可能会增加ART中男婴的出生比例，因此，单胚胎移植囊胚占比大可能是单胚胎移植SRB显著高于双胚胎移植的原因。孙文枫等[17]研究发现，移植1、2、3枚胚胎的SRB分别为119.4∶100、114∶100及107∶100，可以看出随着移植胚胎数量的增加SRB有下降趋势，与我们的研究结果相符。本研究发现，移植1枚卵裂期胚胎的SRB略低于移植2枚卵裂期胚胎，但差异无统计学意义(P>0.05)；
而移植单囊胚的SRB略高于移植双囊胚(P>0.05)，提示移植胚胎数对SRB的影响会受到不同移植胚胎时期的影响。
随着培养液和培养系统的不断改进、实验室人员操作技术的不断优化、胚胎体外培养环境不断改良，这些因素的变化是否会对SRB造成影响？为解答上述问题，本研究统计了2010～2019年我院总SRB的变化趋势发现，SRB没有明显逐年升高或者降低的趋势；
同年份中，卵裂胚移植的SRB低于囊胚移植，ICSI的SRB低于IVF。同一中心近些年若是提高了囊胚移植的比例或者提倡单囊胚移植，SRB就可能有升高的趋势。
综上所述，ART可能会增加男婴的出生，行IVF助孕或移植囊胚可能会增加SRB。为了最大程度减少对出生比例平衡的影响，我们可以试着改变精液处理的方法，提高移植卵裂期胚胎的比例，控制性别比，防止性别比失衡，促进ART的健康发展。
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