张冬雪 石岩岩 丁士刚
北京大学第三医院消化内科 北京大学第三医院临床流行病学研究中心(100183)
幽门螺杆菌(Hp)引起的胃细胞应激适应机制的改变在慢性感染和胃黏膜疾病进展过程中具有重要作用[1-2]。发生Hp感染相关性胃炎后，激发机体过度的氧化反应，激活的中性粒细胞、巨噬细胞和胃上皮细胞过度表达活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)，同时Hp本身亦可生成ROS，导致机体ROS/RNS过度累积[3]。Hp感染引起胃炎后产生的ROS会影响胃上皮细胞间的信号转导，同时过表达的ROS/RNS产物也会引起细胞凋亡和胃上皮细胞DNA损伤。Hp在进化过程中生成了一系列逃逸氧化应激的机制，使机体的氧化应激反应不但未能清除细菌，反而更有助于Hp感染，同时氧化应激破坏了机体自身系统的平衡并造成炎症等多种应激损伤，产生恶性循环，从而促进炎症环境[3]。由于氧化应激生成的过氧化物、一氧化氮(NO)等产物的过表达使胃黏膜损伤加剧，继而明显增强慢性非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生、远端胃腺癌的风险[1]。此外，亚硝化应激和内质网应激亦参与该过程。本文就Hp感染引发的应激的相关机制及其在胃黏膜疾病中的作用作一综述。
Hp导致ROS产生的生化途径主要有两条，即NADPH氧化酶(NOX)和精胺氧化酶(SMOX)[2]。NOX是一种通过质膜传递电子的酶，其电子受体是氧，反应产物是过氧化物。目前已鉴定出7个同源物，分别NOX1～NOX5和2个双氧化酶(DUOX)。有研究发现，Hp感染期间可见NOX1、NOX2和DUOX2表达[4]。一旦病原菌进入体内，中性粒细胞立即吞噬细菌形成吞噬小体，并通过NOX产生的ROS杀死吞噬的病原体。在吞噬过程中，NOX的催化亚单位gp91phox被激活，并接受来自细胞质NADPH的电子。随后，NOX将这个电子给予吞噬小体内或吞噬细胞外的分子氧，产生过氧化物，可被超氧化物歧化酶(SOD)催化或吞噬小体中的非酶歧化为H2O2。H2O2可被动渗透细胞膜，在髓过氧化物酶(MPO)的介导下转化为次氯酸，其毒性为H2O2的100倍[3,5]。亚铁存在的情况下，H2O2还与过氧化物发生非酶反应生成羟自由基。一般而言，这些高活性的ROS被吞噬细胞用来杀死病原菌。而SMOX在上皮细胞和巨噬细胞中表达，并通过对精胺的氧化过程产生H2O2。
感染Hp后，通过一系列氧化应激机制，产生过量ROS，可能是胃黏膜损伤的主要原因。
1. 细胞毒素相关基因A(CagA)：CagA是一种高免疫原性蛋白，分子质量为120～140 kDa(1 Da=0.992 1 u)，由CagA基因编码，其基因位于致病岛末端(CAG PAI)。CagA通过Ⅳ型分泌系统(T4SS)转送至宿主细胞中[6-7]。多项研究结果表明，CagA阳性Hp菌株的感染与更高级别的胃黏膜炎症和严重萎缩性胃炎有关，在胃癌的发生、发展中起有重要作用[6-8]。
Hp感染胃黏膜产生ROS的主要来源是宿主的中性粒细胞，而CagA阳性可影响胃上皮细胞产生ROS。具体机制为：①研究发现CagA阳性Hp感染可使中性粒细胞大量积聚并诱导中性粒细胞氧化爆发增加，产生更多的ROS[2]。②除中性粒细胞外，胃上皮细胞中的ROS产生也显著增加。Hp CagA可上调胃上皮细胞SMOX表达，SMOX将多胺精胺代谢成亚精胺，并产生H2O2，引起ROS积聚、DNA损伤和细胞凋亡[9]。③CagA阳性与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL)-8表达增加显著相关，而这两个指标均为炎症和氧化应激的标志物[9]。④CagA还可诱导线粒体产生ROS：研究发现将CagA基因转染至胃上皮细胞，部分CagA蛋白定位于线粒体，产生大量ROS并伴有线粒体电子传递功能的受损和过氧化物的产生。线粒体DNA(MtDNA)因其离电子传递链很近，且缺乏保护性组蛋白或DNA结合蛋白，相比核DNA更容易受到ROS损伤，可能表现出电子传递功能受损，从而增加电子泄漏和ROS的产生，进一步加剧线粒体的氧化应激和氧化损伤[7]。因此，CagA可诱导胃黏膜发生氧化应激，损伤细胞成分，增强炎症反应，从而可能导致胃癌的发生。
2. 空泡细胞毒素A(VacA)：VacA基因编码VacA蛋白，VacA蛋白由Hp通过V型自转录系统分泌，并通过内吞作用进入宿主细胞，可促进Hp定植，并与炎症和胃癌的风险增加相关。其具体机制为：①VacA通过靶向作用于线粒体膜的内层，诱导Ca2+内流和ROS的产生，从而导致NF-κB的激活和趋化因子表达上调[9-10]。②研究表明VacA通过激活ROS而诱导自噬破坏反应，从而促进Hp的持续定植。VacA通过与低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)结合来诱导自噬，即与LRP1结合导致ROS积聚，促进Akt激活、MDM2磷酸化、p53降解和诱导自噬[9]。③VacA通过降低细胞内谷胱甘肽水平，引起ROS积聚和Akt激活，诱导自噬和CagA降解。总之，VacA可导致细胞ROS的增加，并在Hp感染期间促进炎症和肿瘤环境的形成。
3. 尿素酶和中性粒细胞激活蛋白A(NapA)：尿素酶和NapA是Hp的两个毒力因子，有助于中性粒细胞浸润和ROS的产生。具体机制为：①NapA对中性粒细胞和单核细胞具有趋化作用，通过G蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、Src家族酪氨酸激酶和胞内钙离子浓度等信号通路，使NOX在质膜上组装，从而诱导活性氧中间体(ROI)的产生[4,11]。②NapA还可招募中性粒细胞至感染部位，NapA和尿素酶诱导中性粒细胞发生氧化爆发，将大量ROS泄漏至感染的微环境中，从而导致细胞应激和DNA氧化损伤[12]。③感染过程中尿素酶可诱导巨噬细胞产生反应性氮物质NO，从而促进炎症的发生[9]。Uberti等[13]的研究还发现尿素酶可诱导中性粒细胞浸润、高水平炎症和ROS的产生，并可与其他因子放大胃部的炎症过程。
4. γ-谷氨酰转肽酶(GGT)：Gong等[14]的研究已证实Hp的GGT可诱导宿主细胞氧化应激，导致DNA损伤、细胞凋亡和炎症途径的激活。GGT可引起宿主细胞谷氨酰胺和谷胱甘肽的消耗和ROS的产生[15]。具体机制为：①Hp感染后在周质中产生谷胱甘肽，在宿主细胞中具有抗氧化作用，但Hp的GGT可导致黏膜中谷氨酰胺和谷胱甘肽的消耗，降低细胞外谷胱甘肽水平，降低宿主细胞对ROS的抵抗力，并诱导细胞凋亡或坏死[14-15]。②GGT可通过硫醇依赖的铁还原产生ROS(如H2O2)，通过激活p38MAPK、AKT和NF-κB，进而诱导产生COX-2、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、生长因子和IL-8[15-16]。IL-8在Hp诱导的炎症相关黏膜损伤中起主要作用，而COX-2过表达在Hp相关性胃癌的发生、发展中起关键作用。③研究表明Hp的GGT可导致8-羟基脱氧葡萄糖(8-OH-dG)含量增加，8-OH-dG为DNA损伤的直接标志物和体内ROS产生的替代标志物，从而可认为GGT引起氧化性DNA损伤[9,14]。
5. 脂多糖(LPS)：Hp细菌外膜上LPS可激活中性粒细胞，增强氧化应激反应的启动，其可在中性粒细胞上通过依赖PI3K/RAC1途径诱导NOX1的表达，还可通过刺激Hp表面Toll样受体4(TLR4)产生过氧化物，增加炎症细胞和胃上皮细胞中iNOS表达，从而促进ROS的产生[17]。LPS还可诱导中性粒细胞快速氧化爆发，使Hp感染持续存在，从而诱导宿主炎症反应和氧化应激，导致慢性炎症、消化性溃疡、胃炎和进一步胃癌的发生[16]。
Hp可诱导胃黏膜上皮细胞、血管内皮细胞或浸润的炎症细胞表达iNOS[18-19]，将L-精氨酸转化为NO，也可上调内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达生成NO，NO会产生各种RNS[19]。NO可与金属离子，如血红素和铁硫蛋白中的Fe2+产生亚硝酰化反应，从而影响细胞功能[20-21]。NO与NADPH氧化酶产生的超氧化物结合生成一种强氧化剂过氧亚硝酸盐(ONOO-)[17,21]，分别通过产生硝基酪氨酸和DNA加合来损伤蛋白质和DNA[22]，从而产生毒性效应。此外，细胞内的游离金属或与蛋白质结合的金属可促进NO单价氧化成亚硝酸根离子，其与谷胱甘肽相连接形成有毒的S-亚硝基谷胱甘肽[23]。NO可自动氧化成N2O3并导致DNA碱基脱氨[17]，过氧亚硝酸根也促进DNA碱基的硝化，从而诱导DNA损伤，对Hp和宿主组织产生毒性作用[24]。实验表明在Hp感染引发的慢性胃炎中，NO、iNOS、eNOS表达显著增加[19,22]。与此同时，iNOS和eNOS过表达也促使机体产生更多的氧自由基，氧化应激反应会促使eNOS发生谷胱甘肽化反应，加剧超氧化物的产生。NOS与ROS协同作用，创造一个有利于DNA损伤和肿瘤转化的环境[9]。
内质网主要通过控制蛋白质的折叠和运输在细胞中发挥关键作用，从而参与维持细胞功能和存活。
内质网应激是由于未折叠和(或)错误折叠的蛋白质在内质网管腔中聚集，可激活未折叠蛋白反应(UPR)，通过激活细胞内信号级联反应，从而导致内质网结构和功能失衡。UPR早期通过各种机制以重建细胞内外平衡以及恢复稳态和正常的内质网功能，但当压力超出UPR的代偿功能时，会导致细胞炎症和凋亡[25-26]。内质网的应激转导因子包括蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、肌醇需求因子1 (IRE1)和活化转录因子6(ATF6)[25]。在正常生理状态下，内质网腔区域的3个跨膜受体蛋白PERK、IRE1和ATF6与钙网织蛋白和葡萄糖调节蛋白78(GRP78/BiP)处于结合状态，形成稳定的复合物，处于未激活状态。当未折叠蛋白在内质网中增加时，GRP78从PERK、ATG-6和IRE1中释放，从而激活3个内质网压力传感器，产生UPR信号级联反应[23]。尤其是PERK的激活，可通过真核起始因子(EIF2)-α的磷酸化而诱导C/EBP同源蛋白(CHOP)表达[27]。CHOP抑制抗凋亡蛋白Bcl的表达，激活促凋亡BH3蛋白，是内质网应激诱导细胞凋亡的关键介质。另一个关键蛋白IRE1α可直接结合肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)，促进凋亡信号调节激酶(ASK1)及其下游激酶活化，最终过通JNK激活caspase-12，诱导细胞凋亡[28]。
慢性Hp感染的压力会导致内质网应激，Baird等[29]发现Hp阳性的胃癌与内质网应激的激活和UPR显著相关(92%)，HSPA5在Hp阳性患者肠化生中的表达增加，而HSPA5高表达与多种UPR效应器失调有关，并与人类和小鼠胃黏膜中与Hp有关的肿瘤级联反应中的非细胞自主诱导内质网应激有关。在长时间内质网应激下，Hp可能通过激活UPR促进肿瘤细胞的增殖。说明对UPR的诱导发生在肠化生至异型增生的演变早期。还有研究发现在Hp阳性的肠化生中，由内质网应激所激活的UPR中关键因子Bip、CHOP、IRE1α等的表达高于无萎缩的胃黏膜[25,30]，表明Hp诱导的内质网应激可能在癌前病变形成的早期阶段发挥重要作用。研究发现Hp VacA可诱导胃上皮细胞的内质网应激，其分泌抗原HP0175来激活PERK，从而激活ATF4和CHOP，诱导AGS细胞自噬和凋亡[25,30-31]。
急性Hp感染时缺乏内质网应激反应，提示UPR激活可能是胃上皮细胞对慢性Hp感染的一种修复反应。在Hp感染的胃黏膜中，慢性炎症所致的长时间内质网应激触发了UPR的激活，而CHOP介导的细胞凋亡可促进黏膜萎缩的发展，HSPA5过表达驱动的增殖可诱导肠化生向胃癌进展。UPR作为一种适应性反应，Hp所致的慢性炎症时可能促使细胞沿着肠化生-异型增生途径进展。
综上所述，Hp感染后炎症的发生是由于多种损伤因素叠加引起的，包括应激，尤其是氧化应激、亚硝化应激和内质网应激。总结并研究应激相关的机制，有助于更好地了解Hp感染在胃黏膜疾病中的重要作用，可能是治疗Hp相关胃炎的慢性炎症并阻止癌变发生的一个重要的新策略。
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