戴盼盼 张 鹏 陈申国 施更生 林海升
牙周炎是发生在牙支持组织的由牙菌斑中的微生物所引起的慢性感染性疾病,是中国成人失牙的首位原因[1]。
大量临床研究表明,糖尿病患者牙周炎发病风险及严重程度更高,因而糖尿病性牙周炎成为了牙周病预防及治疗中的难点和重点,探讨两者的共同致病因素及作用靶点是目前研究的关键[2,3]。
甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)是葡萄糖代谢的有毒产物,在糖尿病患者的血浆以及牙周炎患者的龈沟液中高浓度存在,远高于正常人水平[4]。
亲环蛋白D(cyclophilin D, CypD)作为线粒体膜通透转换孔(mitochondrial membrane transition pore, mPTP)的重要组成蛋白,其激活后导致mPTP 的开放,进而影响线粒体功能,最终细胞凋亡[5]。
目前,关于CypD 在MG诱导成骨细胞凋亡中的作用鲜见报道。
因此,本研究拟构建MG 诱导成骨细胞凋亡模型,探讨CypD 在其中的作用。
1.材料：α-MEM 培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco 公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、TUNEL试剂盒购自瑞士Roche 公司;CypD 一抗购自英国Abcam 公司;β-actin 一抗购自美国Sigma 公司;二抗购自碧云天生物技术有限公司;环孢菌素A (CsA)购自美国Cell Signaling Technology 公司;四甲基罗丹明乙酯(TMRM)、线粒体绿色荧光探针(Mitogreen)购自美国Life Technologies 公司。
2.细胞培养及处理：小鼠MC3T3-E1 细胞系购自美国ATCC 细胞库,将细胞培养于α-MEM 细胞完全培养基(含100U/ml 青霉素G 和100ng/ml 链霉素),待细胞长至70% ～80% 融合时弃旧培养基,0.25%胰蛋白酶消化,按1 ∶3 比例进行接种传代,培养瓶置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
细胞处理：对照组：α-MEM 培养基培养24h;MG 组：半数抑制浓度的MG 培养24h;CsA 组：1μmol/L CsA 培养25h;CsA +MG 组：1μmol/L CsA 预培养1h,再加入半数抑制浓度的MG 培养24h。
3.细胞存活率检测：采用MTT 法进行检测。
将处于对数生长期的细胞消化后,调整细胞密度至105个/毫升的浓度接种于96 孔板中,铺好板后,置37℃、5% CO2培养箱培养,24h 后按实验分组加药。细胞处理后吸弃孔内原培养基,换成无血清培养基,每孔加入20μl 5mg/ml 的MTT,37℃、5%CO2培养箱避光培养4h;吸弃上清液后每孔加入150μl DMSO,避光低速震荡10min,酶标仪490nm 检测A值。
细胞存活率(%) =(各实验组A值-调零孔A值)/(对照组A值-调零孔A值) ×l00%。
4.细胞凋亡检测：采用TUNEL 染色法进行检测。
将细胞爬片取出,用4% 多聚甲醛溶液室温固定1h,2 ～8℃下用体积分数0.1% Triton X-100 和质量分数0.1%柠檬酸钠的配液静置2min,50μl 反应液37℃避光孵育1h,用含有DAPI 的封片剂封片,正置荧光显微镜观察拍照,计数300 个细胞计算凋亡率。
5.蛋白表达检测：采用Western blot 法检测,将蛋白裂解超声后高速离心机4℃1200r/min 离心取上清液,BCA 法检测蛋白浓度,加入上样缓冲液,将蛋白煮沸变性后上样, SDS-PAGE 电泳分离,蛋白电转至PVDF 膜,脱脂奶粉室温封闭1h,加入含一抗的稀释液中(CypD 1 ∶2000,β-actin 1 ∶2000),4℃过夜。洗膜后加入二抗室温孵育1h,化学发光成像仪曝光,扫描图像并用image J 软件分析灰度。
6.线粒体膜电位的检测：采用TMRM 染色法进行检测。
将对数生长期的细胞低密度铺板于24 孔板中,处理后用TMRM(终浓度100nmol/L)和Mitogreen(终浓度100nmol/L)37℃培养箱避光孵育30min,漂洗细胞两次后用倒置荧光显微镜进行观察拍照,其中TMRM 用绿色荧光激发,Mitogreen 用蓝色荧光激发。
7.统计学方法：应用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行统计分析,结果进行单因素方差分析以及LSD-t检验,计量数据以均数±标准差(±s)表示,以P＜0.05 为差异有统计学意义。
1.MG 对成骨细胞增殖活性的影响：图1 MTT 结果表明,采用不同浓度的MG(100、200、400、600、800μmol/L)处理成骨细胞,24h 后可见MG 明显抑制成骨细胞增殖活性,细胞活性分别为96.54%、90.22%、80.74%、50.86%、4.81%,表明MG 浓度越高,抑制作用越明显。
此外,600μmol/L 的MG 处理后细胞活性达到半数抑制率,故后续实验以该浓度作为处理条件。
图1 不同浓度MG 对成骨细胞增殖的影响
2.MG 对成骨细胞凋亡的影响：TUNEL 染色结果显示,与对照组比较,600μmol/L 的MG 处理后阳性染色率明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05,图2)。
图2 MG 对成骨细胞凋亡的影响(TUNEL 染色, ×200)
3.MG 对CypD 蛋白表达的影响：Western blot 法检测结果所示,MG 组CypD 蛋白表达较对照组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05,图3)。
图3 MG 对CypD 蛋白表达的影响
4.CypD 蛋白抑制剂CsA 对细胞凋亡的干预作用：MTT 结果表明,与MG 组比较,CsA 预处理能够显著恢复MG 对成骨细胞增殖活性的抑制,并且其单独处理对细胞活性无影响(图4)。
此外,TUNEL 结果显示,CsA +MG 组较MG 组显著减少了细胞阳性染色率(图4 中B、C)。
图4 CypD 蛋白抑制剂CsA 对细胞凋亡的干预作用
5.CypD 蛋白抑制剂CsA 对CypD 蛋白表达的影响：Western blot 法检测结果表明,与MG 组比较,CsA预处理减少了CypD 蛋白的表达(图5)。
图5 CsA 对CypD 蛋白表达的影响
6.MG 对成骨细胞线粒体膜电位的影响：与对照组比较,MG 组电势测定荧光探针染料TMRM 染色强度降低,而CsA 预处理后荧光强度部分恢复(图6)。
图6 MG 对成骨细胞线粒体膜电位的影响(TMRM 染色结果, ×200)
牙周炎是一种由微生物引发的慢性多因素炎症性疾病,其特征是牙周组织被破坏,临床表现为附着丧失、牙周袋、牙龈出血和牙槽骨吸收,其患病率随着年龄的增长而逐渐增加[6]。
研究发现,牙周炎与多种全身性疾病有关,包括心血管疾病、2 型糖尿病、呼吸系统疾病、慢性肾病和代谢综合征,其中以糖尿病相关性牙周炎发病最为密切[7]。
据统计,全世界成人糖尿病患者数已高达4.25 亿,糖尿病患者得牙周炎概率明显高于正常人,并且发病更早,进展更迅速,症状更严重[8]。
Merchant 等[9]研究发现,长期牙周维护改善了2 型糖尿病伴牙周炎患者的血糖控制。
因此,探讨糖尿病病理条件下糖尿病与牙周炎的共同致病因素及其作用靶点是目前研究的重点。
MG 是葡萄糖代谢的有毒产物,主要由糖酵解中间体、3-磷酸甘油醛和磷酸二羟基丙酮的低水平降解形成[10]。
糖尿病中MG 的异常积累导致蛋白糖基化增加,形成晚期糖基化终产物,是糖尿病血管并发症发展的一个重要致病因素[11]。
此外,研究证实,牙周炎龈沟液中福赛斯坦纳菌分泌高浓度的MG,与牙周炎的病程进展密切相关[4]。
Settem 等[12]研究发现,牙周组织中MG 诱导单核细胞分泌促炎性细胞因子,导致牙槽骨的病理性骨丧失。
Retamal 等[13]研究证实,MG 在牙周炎中的发病机制可能与诱导牙龈成纤维细胞凋亡以及胶原蛋白的变性有关。
本研究选用的MG 半数抑制浓度为600μmol/L,远小于牙周炎龈沟液中23mmol/L 的浓度,实验具有临床意义。
根据MTT 及TUNEL 染色结果可见,MG 抑制成骨细胞增殖活性,并且诱导细胞凋亡,与既往研究结果相符[12]。
线粒体是细胞的动力工厂,其损伤会导致细胞能量生成障碍,进而导致细胞功能失调,最终发生病理性凋亡,并且已有研究证实线粒体功能障碍与糖尿病性牙周炎密切相关[14,15]。
CypD 作为mPTP 的重要组成蛋白,在维持mPTP 开放及线粒体功能中发挥着重要作用。
在损伤应激刺激下,mPTP 开放造成线粒体内部离子平衡紊乱、线粒体肿胀、ATP 水平下降、凋亡活性物质释放入胞质,最终促使细胞凋亡的发生。
化学性抑制或基因敲除CypD 均可有效恢复线粒体功能障碍介导的细胞损伤[16]。
Chen 等[17]研究发现,小鼠实验组牙周炎伴随着牙槽骨CypD 表达增加。
He等[18]研究证实,CypD 与地塞米松引起的牙龈损伤有关,体外细胞实验进一步证实,对CypD 阻断可以减少牙龈上皮细胞线粒体活性氧的形成,恢复线粒体功能,从而减少细胞凋亡。
而CypD 与糖尿病相关牙周炎中成骨细胞凋亡的关系目前鲜见报道。
本研究通过Western blot 法检测发现,MG 导致成骨细胞CypD 蛋白表达增加,说明CypD 很可能参与了MG 诱导的成骨细胞凋亡。
因此,笔者采用其特异性抑制剂CsA 进行干预,发现CsA 在减少CypD 蛋白表达的同时,显著恢复了成骨细胞的增殖活性以及减少细胞凋亡,说明CypD 与MG 诱导的成骨细胞凋亡密切相关。
为了进一步验证CypD 的调控作用是否与线粒体功能有关,笔者检测了线粒体膜电位。
如图6 所示,与MG 组比较,CsA 预处理可以缓解MG对线粒体膜电位的抑制作用,因此,笔者认为,CypD是通过调控线粒体功能来介导MG 诱导的成骨细胞凋亡。
综上所述,本研究认为MG 可能通过上调CypD表达,抑制线粒体功能,进而诱导成骨细胞凋亡,这将为防治糖尿病性牙周炎牙槽骨吸收提供新的靶点。
猜你喜欢 成骨细胞牙周炎线粒体 线粒体质量控制在缺血性脑卒中的作用研究进展医学研究生学报(2022年5期)2022-12-07特发性肺纤维化中的线粒体质量控制临床肺科杂志(2022年3期)2022-11-26线粒体自噬在纤维化疾病中作用的研究进展中华实用诊断与治疗杂志(2022年1期)2022-08-31替硝唑局部用药治疗牙周炎的临床效果中国药学药品知识仓库(2022年7期)2022-05-10重度牙周炎牙齿的牙髓治疗时机及牙周牙髓联合治疗对重度牙周炎的疗效观察锦州医科大学报(2022年2期)2022-05-07口腔护理干预在慢性牙周炎患者种植治疗中的应用效果中国典型病例大全(2022年7期)2022-04-22牙周联合牙髓治疗重度牙周炎的效果研究中国典型病例大全(2022年9期)2022-04-19啤酒花经抗氧化途径减轻Aβ 损伤成骨细胞作用研究药学实践杂志(2021年6期)2021-12-04线粒体自噬在蛛网膜下腔出血中的研究进展中国卒中杂志(2021年7期)2021-11-29微小核糖核酸-1205沉默Cullin-RING泛素E3连接酶4A激活AMPK信号传导保护人成骨细胞免受地塞米松损伤的研究中华骨与关节外科杂志(2021年12期)2021-08-31