曹云松 王亚萍 徐 阳 郭 普 汪华学
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant toStaphylococcusaureus，MRSA)是院内感染的主要病原菌之一。1961年Jevons等[1]在英国首次发现MRSA至今，其感染率和检出率逐年上升，波及全球。由于抗生素种类日益增多及不合理使用，导致院内感染的MRSA常具有多重耐药性和高致病性，临床治疗较为困难，MRSA已成为感染医学中最受关注的问题之一[2-3]。因此对于重症感染患者，快速、准确的检出MRSA有助于合理选择抗菌药物、提高患者的生存率和控制院内病原菌的传播。传统的表型鉴定耐药菌的方法一般检测周期较长，不能实现耐药菌快速、自动化检测的需要。以16S rRNA基因测序为代表的分子生物学鉴定方法具有较高的准确性和稳定性，但由于其成本及技术要求，很难在实验室之外广泛应用[4]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技术在临床病原微生物鉴定方面已经非常成熟，通过直接分析微生物的核糖体蛋白即可确定种属，具有准确、高效、高通量等优点[5-7]。近年来，MALDI-TOF MS 在耐药菌检测中的应用逐渐增多,如MALDI-TOF MS用于检测β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌[8]、鉴定耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌[9]，Giordano等[10]利用该技术对耐多粘菌素的肺炎克雷伯菌进行检测。本研究应用VITEK MS SARAMIS系统，通过分析MRSA与MSSA特征峰上的差异，分别建立MRSA与MSSA的SuperSpectra，并对新建数据库进行验证，明确MALDI-TOF MS技术能否实现对MRSA和MSSA的快速鉴别。
1.1 实验材料
1.1.1 标本及菌株来源 2020年7月至2021年9月在蚌埠医学院第一附属医院微生物室收集患者送检标本中分离出的金黄色葡萄球菌285株(相同患者同一部位的重复菌株取首次分离菌株)。临床送检标本中痰液75例(26.3%)、分泌物92例(32.2%)、脓液61例(21.4%)、全血32例(11.2%)、其他25例(8.7%)。仪器质控菌株：大肠埃希菌ATCC 8739；
质控标准菌株：ATCC 43300(MRSA)、ATCC 29213(MSSA)，由国家卫生健康委临床检验中心提供。
1.1.2 主要仪器及试剂 头孢西丁(Cefoxitin, FOX)药敏纸片：英国 Oxoid 公司；
VITEK MS质谱仪、靶板、CHCA基质液、VITEK Densichek 比浊仪：法国生物梅里埃公司；
哥伦比亚血琼脂平板、MH琼脂平板：合肥天达试剂公司；
DNA Marker DL2000、Taq masterMix：北京天根生化科技有限公司；
PCR扩增仪和凝胶成像仪：美国Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离培养与种属鉴定 严格按照《全国临床检验操作规程》第4版操作要求，将收集的菌株接种于哥伦比亚血琼脂平板，培养时间均为18～24 h，传代分离至单个菌落。按照质谱仪操作流程采用直接涂布法进行鉴定，用1 μL接种环挑取血平板上的单一菌落，均匀涂布在靶板上，并记录点样位置及对应的菌株编号，最后挑取大肠埃希菌ATCC 8739菌落，均匀涂抹于校准孔位上，然后分别加1 μL CHCA基质液，等待基质液完全干燥后将靶板放入质谱仪中进行检测，选择MALDI-TOF MS RUO模式，获取菌株蛋白指纹图谱，并与SARAMIS数据库中的图谱进行比对，以可信度百分比作为图谱一致性的判断标准，可信度百分比高于75%表示鉴定结果准确。
1.2.2 耐药菌株初筛 采用头孢西丁(30 μg)纸片扩散法对285株SA进行药敏试验，用游标卡尺测量SA对药敏纸片的抑菌环直径(以肉眼看不到抑菌环的边缘有细菌明显生长为标准)，结果按2021版CLSI M100 31th药敏标准执行，抑菌环直径≤21 mm为耐药菌株，≥22 mm为敏感菌株。
1.2.3 PCR检测 采用煮沸法提取285株SA的基因组DNA，用作PCR反应扩增的模板，参照研究[11]委托上海生物工程有限公司合成特异引物(引物序列mecA-F:5’-ACGAGTAGATGCTCAATATAA-3’；
mecA-R:5’-CTTAGTTCTTTAGCGATTGC-3’)，对SA耐药基因mecA进行检测，PCR反应体系(25 μL)：PCR Mixture 12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、超纯水补足至25 μL，提取后的基因组DNA进行耐药菌株扩增，PCR扩增阳性产物送至上海生物工程有限公司进行基因测序，所得结果上传至GenBank数据库进行比对分析。
1.2.4 SuperSpectra的构建及验证 利用VITEK MS SARAMIS软件建立SuperSpectra，选择60～70株MRSA图谱(采用甲酸萃取法获得图谱)，选择所有菌株共有的39～41个峰，峰的数量在80～230之间，和SARAMIS数据库进行比对，分析MRSA特征图谱重合率和特征峰质荷比，创建得到MRSA SuperSpectra并激活用于鉴定。采用同样的方法建立MSSA SuperSpectra并激活。选择建库以外的SA菌株，应用新建的MRSA和MSSA SuperSpectra进行验证，并与PCR结果进行比较，评价VITEK MS对MRSA和MSSA的鉴定价值。
2.1 菌株鉴定及纸片扩散法结果 本实验收集285株临床菌株，经VITEK MS质谱仪确认均为SA，对所有菌株进行头孢西丁药敏纸片筛选，根据CLSI标准，其中153株为MRSA，头孢西丁抑菌圈直径 6～19 mm；
132株为MSSA，头孢西丁抑菌圈直径 23～32 mm。
2.2 PCR结果 对285株金黄色葡萄球菌进行mecA基因扩增，结果提示结果153株MRSA均携带mecA基因，132株为MSSA均未携带mecA基因，部分电泳图结果见图1。
注：M为DNA Marker；
-为阴性对照;+为阳性对照；
1～8为菌株编号。
2.3 SuperSpectra结果 在153株MRSA菌株中选取65株，并加入ATCC 43300，共66株MRSA建立 SuperSpectra，特征峰纳入标准：菌株分类值均>70%，最终保留40个MRSA的特征峰以保证每种质量峰至少是80%的图谱所共有，通过VITEK MS SARAMIS软件对保留的特征峰与数据库图谱比较，确定波峰的权重值，得到MRSA SuperSpectra。在132株MSSA菌株中选取60株，并加入ATCC 29213，共61株MSSA，同样的方法得到 MSSA SuperSpectra。设置误差范围error值<0.05，MRSA和MSSA SuperSpectra的特征图谱重合率70%，其中MRSA的主要特征峰为3 036.0、3 875.3 Da，MSSA特有的峰为5 054.0 Da，这3个峰可以作为区别MRSA和MSSA 的主要特征峰。MRSA和MSSA的特征峰比较见图2。
图2 MRSA(蓝色峰)和 MSSA(红色峰) SuperSpectra 比较
2.4 菌株验证结果 选择建库外的160株SA验证新建MRSA和MSSA SuperSpectra 的鉴定准确率，结果显示在表1中，经PCR确认的88株MRSA中，VITEK MS鉴定正确率为89.8%(79/88)，5株被误判为MSSA，4株未获得结果；
经PCR确认的72株MSSA中，VITEK MS鉴定正确率为87.5%(63/72)，6株被误判为MRSA，3株未获得结果。见表1。
表1 PCR法与VITEK MS鉴定结果比较(株)
重症监护病房(intensive care unit，ICU)是MRSA感染的高发科室，收治的危重患者由于基础疾病多、免疫功能低下，重症感染的发生率较高，往往需要长时间、大剂量广谱抗生素治疗，易导致病原菌耐药性不断增加[12,13]。本实验共收集我院285株金黄色葡萄球菌菌株，筛选出153株MRSA，检出率为53.7%(153/285)，分离率高于2020年全国细菌耐药监测结果31%[14]，但与郭普等[15]对本院的细菌耐药监测结果相似，2017年我院临床分离的金黄色葡萄球菌中MRSA为54.7%。目前，临床上治疗MRSA的药物极其有限，仅有万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁等少数抗菌药物，而其首剂使用的时机和效果则有赖于耐药菌的早期鉴定。因此，早期精准识别MRSA并分析其流行病学信息，可以有效控制院内感染的暴发流行，对预防和治疗MRSA引起的重症感染有重要作用。
MALDI-TOF MS技术通过微生物蛋白质指纹图谱来进行耐药菌的鉴定，由于多重耐药的革兰阴性杆菌的耐药机制较为复杂，往往伴随着细胞膜通透性改变、外排泵形成等多种机制协同作用，单纯依靠蛋白质特征峰度的改变往往很难准确对其鉴别。MRSA的耐药机制相较于多重耐药阴性杆菌略显简单，mecA基因是MRSA耐药性的决定基因，通过PCR检测mecA基因被认为是MRSA检测的“金标准”[16,17]。夏雯等[18]通过PCR方法检测某院ICU肺炎患者痰液标本中分离出的MRSAmecA基因携带率为100%。2016年，Koupahi等[19]比较了4种表型鉴定方法与PCR法检测MRSA，结果发现头孢西丁纸片扩散法和PCR检测的结果一致，灵敏度和特异度均为100%，苯唑西林纸片扩散法的灵敏度为95.42%。因此，本研究采用了头孢西丁纸片扩散法与PCR法筛选MRSA，且2种方法的鉴定符合率为100%。
目前，全球市场中基于MALDI-TOF MS技术的微生物鉴定主要是MALDI BioTyper系统和VITEK MS系统[20]。国外学者[21]最早利用质谱仪对金黄色葡萄球菌进行快速区分，发现大多数质谱峰为葡萄球菌所共有，部分为MRSA所特有，部分为MSSA所特有，且质谱峰数量MRSA多于MSSA，由此发现质谱仪具备区分MRSA和MSSA的能力。2014年，Lasch等[22]采用MALDI-TOF MS来分析MRSA和MSSA的特征峰，但最终结果未能直接发现两者蛋白图谱的差异。Hu等[23]在2015年报道MALDI-TOF MS可用于准确鉴定葡萄球菌属，并发现MSSA的特征峰集中在3 279、6 485、6 555 m/z，MRSA的特征峰为3 299 m/z，MSSA 及MRSA的准确鉴定率分别为90.9%和83.3%，但该研究中采用的是MALDI Biotype系统及ClinProTools 3.0软件。同样，2018年Wang等[24]通过ClinProTools软件分析出了MRSA在2 082～6 594 m/z范围10个最特异性的峰值。这些报道均采用BioTyper系统进行检测，利用聚类分析和统计学方法，需要对比多株细菌图谱，不适用于临床单个菌株的快速鉴定。本研究以PCR结果为“金标准”，利用VITEK MS系统比对分析MRSA和MSSA图谱的差异，建立两者各自的SuperSpectra并用于临床鉴定。此方法可以在10min内实现单个样本的快速鉴定，具有高通量、敏感度高、特异度高等优点，弥补了传统的MRSA鉴定方法操作复杂、耗时长等缺点。通过SuperSpectra的差异发现质荷比为3 036.0、3 875.3 Da为MRSA的主要特征峰，而质荷比为5 054.0 Da为的MSSA的主要特征峰，新建SuperSpectra对MRSA和MSSA鉴定正确率分别为89.8%和87.5%，结果表明新建SuperSpectra可以快速区分MRSA和MSSA，可用于对本地区MRSA的快速筛选。本研究中的特征峰与文献报道[23-24]不同，可能受到不同实验条件及所收集菌株分布流行的地区差异，导致蛋白质指纹图谱的差异，从而影响特征性峰的变化。本研究所收集菌株均来源于同一家医院，后续将进一步纳入多中心不同来源的样本进行分析，进一步验证所建SuperSpectra的适用范围。
有研究[25]表明培养条件和菌体蛋白提取方法会影响获得的图谱质量，从而影响建库的质量控制，因此本研究建立SuperSpectra时尽可能统一培养条件并采用了VITEK® MS Plus手册中的标准蛋白提取方法，但由于微生物生长环境不同及其他干扰因素，蛋白质的特征峰会出现一定的误差，因此建库时设置特征峰error值<0.05是可接受的误差范围。本研究新建MRSA SuperSpectra在验证过程中出现了4株未获得结果的菌株，通过比较图谱，4株耐药菌在3 036.0 Da和3 875.3 Da处出现特征峰，而在5 054.0 Da处没有特征峰，可能是由于这些菌株与SARAMIS数据库中标准菌株的特征峰重合率更高，因而未被新建SuperSpectra识别。验证过程中有5株MRSA，经SuperSpectra鉴定为MSSA，可能是由于菌株来源、培养条件及抗菌药物的压力作用等因素，导致菌体蛋白的表达出现差异，建库特征峰未能准确匹配，从而影响了鉴定结果。及时完善数据库指纹图谱可以提高鉴定的准确率及效率，因此SuperSpectra通过每年的更新，进一步增加具有地域分布特征的耐药菌株和敏感菌株到数据库中，以减少数据库对未知菌株误判和漏判的情况发生。
综上所述，VITEK MS在新建SuperSpectra的基础上，有助于快速鉴别MRSA和MSSA，且具有操作简捷、准确、灵敏的优点。
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