滕海英，肖建平，付仰志，石小峰
（1.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州 350003；
2.福建省康复技术重点实验室，福建 福州 350003）
抑郁症是一种高病死率、高致残率，以情绪障碍为主要表现的慢性精神类疾病，严重影响人们的身心健康［1］。目前抗抑郁西药在治疗抑郁症的过程中仍存在毒副作用大且易复发的局限性［2］，因此许多学者将关注的焦点指向天然药用植物和中药复方，以期从中获取有效的抗抑郁药物。柴胡疏肝散是疏肝理气代表方剂，以疏肝解郁、行气止痛为主要功效，诸药相辅相成，具有良好的抗抑郁作用［3］。PI3K/Akt信号通路作为近几年重点关注的机制通路之一，其在中药抗抑郁治疗以及作用机制研究方面受到人们的重点关注［4］。有研究发现柴胡疏肝散的抗抑郁作用可能受到PI3K/Akt信号通路的影响［5］，因此本研究探讨柴胡疏肝散对慢性不可预见性温和应激（CUMS）抑郁模型大鼠海马PI3K/Akt信号通路以及去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）的影响，为柴胡疏肝散在抗抑郁的临床研究和应用方面提供依据。
1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠48只，体质量180～200 g，由福州诺敦斯生物科技有限公司提供，动物许可证号为SCXK（浙）2019-0002，置于福建省中医药科学院比较医学实验中心饲养。除正常组外，单笼孤立饲养，饲养环境安静，室温（20±2）℃，湿度（50±10）%，每日光照12 h，自由摄食和饮水。
1.2 药物与试剂 柴胡疏肝散颗粒剂购自福建中医药大学附属康复医院颗粒药房；
文拉法辛胶囊（成都康弘药业集团股份有限公司，批号：201203，规格：25 mg/粒）；
BCA蛋白浓度测定试剂盒、裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、上样缓冲液、转模缓冲液均购自上海碧云天生物科技有限公司；
兔抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt均购自武汉亚科因生物科技有限公司，货号：ABP50495、ABP 52202、ABP0030、ABP0059；
NE试剂盒、5-HT试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司，批号：2202R23、2202R16；
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（德国Millipore公司）。
1.3 实验仪器 PowerPac Basic型电泳仪、Mini Trans- blot型转印槽、Gel Doc XR＋凝胶成像分析系统、680全自动酶标仪均购自美国Bio-Rad公司。
2.1 药液的制备 柴胡疏肝散（柴胡12 g，陈皮12 g，炙甘草3 g，白芍9 g，川芎9 g，香附9 g，枳壳9 g），由福建中医药大学附属康复医院颗粒药房配制免煎颗粒剂，一剂药加蒸馏水5 mL，研磨均匀后，加蒸馏水定容至14 mL，即得浓度为4.500 g/mL柴胡疏肝散药液，另取柴胡疏肝散药液与蒸馏水1∶1及1∶3稀释，即得浓度为2.250、1.125 g/mL柴胡疏肝散药液。取3粒文拉法辛胶囊粉末，加蒸馏水10 mL，研磨均匀后，加蒸馏水定容至25 mL，即得浓度为3 mg/mL文拉法辛溶液。
2.2 实验建模 将48只SD大鼠随机分为正常组8只和建模组40只，建模组参照文献［6］的方法以CUMS结合孤养方法构建抑郁症大鼠模型。在实验第1～28天，每日对建模组施加不规律的禁食（24 h）、禁水（24 h）、束缚（3 h）、倾斜笼（45°，24 h）、潮湿（24 h）、冷水游泳（10 ℃，5 min）、热刺激（45 ℃，3 min）、夹尾5 min等CUMS条件，选择1～2种条件随机安排，以避免大鼠产生适应。当大鼠主要表现为饮水量显著降低、毛色暗淡、体质量减轻、糖水偏好指数下降等抑郁症状时，提示建模成功［7］。
2.3 分组与给药 建模成功后，将40只建模组大鼠随机平均分为模型组、文拉法辛组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。低、中、高剂量组分别以1.125、2.250、4.500 g/mL柴胡疏肝散药液（相当于临床人日用量的6.3、12.6、25.2倍），文拉法辛组以3 mg/mL文拉法辛溶液（相当于临床人日用量的6.3倍）［6］，正常组与模型组以生理盐水，每日均按体质量0.5 mL/100 g灌胃1次，连续给药14 d。给药期间，除正常组外，其余各组继续给予CUMS。
2.4 组织标本的采集 实验结束后，大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥麻醉，腹主动脉采血，分离血清，-80 ℃冻存。采血后，断颈处死，断头取脑，冰上剥离海马组织，生理盐水冲洗，迅速置入液氮，后转入-80 ℃冰箱冻存。
2.5 指标测定
2.5.1 大鼠体质量 记录实验前后各组大鼠体质量，比较各组大鼠体质量变化情况。
2.5.2 大鼠行为学观察 ① 糖水偏好实验（SPT）：大鼠单笼饲养，实验前先训练大鼠24 h糖水适应；
按照文献［8］方法，经1瓶白水与1瓶1%蔗糖水饮用适应12 h和禁食禁水12 h后，在禁食下给予1瓶白水与1瓶1%蔗糖水饮用，记录12 h白水和蔗糖水的消耗量，计算大鼠糖水偏好指数，计算公式：糖水偏好指数＝糖水消耗量/（白水消耗量＋糖水消耗量）×100%。② 强迫游泳实验（FST）：按照文献［9］方法在底部直径20 cm、高度45 cm的透明圆柱形游泳筒内进行FST。实验前1 d进行15 min的强迫游泳适应性训练，水温保持（25±1）℃，摄像机记录6 min，记录时间6 min内后4 min大鼠呈现不动状态的时间。
2.5.3 Western blot检测海马组织p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相对表达量并计算p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值 海马组织经组织裂解液裂解后，匀浆后离心取上清液，进行蛋白相对表达量测定。经SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质后，转膜至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭1 h，兔一抗GAPDH（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的兔二抗（1∶10 000）孵育1 h，显影后应用Image-J软件分析条带灰度值，GraphPad Prism 6软件统计分析并作图。内参为GAPDH，目标蛋白条带与GAPDH灰度值的比值为相对表达量。
2.5.4 ELISA法检测海马组织NE、5-HT含量 根据NE、5-HT的ELISA试剂盒的说明书方法进行测定，利用全自动酶标仪检测450 nm吸光度，以吸光度为纵坐标，以标准品剂量为横坐标，绘制标准曲线。
2.5.5 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布的以（±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。
3.1 各组大鼠体质量比较 干预后与正常组比较，模型组体质量显著降低（P＜0.01），表现为抑郁特征；
干预后与模型组比较，文拉法辛组、低剂量组、中剂量组、高剂量组体质量均升高（P均＜0.05或0.01）；
干预后与文拉法辛组比较，低、中、高剂量组体质量差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。
表1 各组大鼠干预前后体质量比较（±s） g
表1 各组大鼠干预前后体质量比较（±s） g
注：与正常组比较，1） P＜0.01；
与模型组比较，2） P＜0.05，3） P＜0.01。
3.2 各组大鼠行为学指标比较 干预后与正常组比较，模型组糖水偏好指数显著降低，强迫游泳不动时间显著延长（P均＜0.01），表现为抑郁行为特征；
干预后与模型组比较，文拉法辛组、低剂量组、中剂量组、高剂量组糖水偏好指数均升高，强迫游泳不动时间均减少（P均＜0.05或0.01）；
与文拉法辛组比较，低剂量组糖水偏好指数降低（P＜0.05），中、高剂量组差异均无统计学意义（P均＞0.05），结果表明柴胡疏肝散具有改善抑郁行为的作用。见表2。
表2 各组大鼠的行为学指标比较（±s）
表2 各组大鼠的行为学指标比较（±s）
注：与正常组比较，1） P＜0.01；
与模型组比较，2） P＜0.05，3） P＜0.01；
与文拉法辛组比较，4） P＜0.05。
3.3 各组大鼠海马组织p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相对表达量与p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比较 柴胡疏肝散可能通过调节PI3K/Akt信号通路关键蛋白发挥抗抑郁作用，上调相关通路蛋白PI3K、Akt的磷酸化水平。见图1。
图1 各组大鼠海马组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比较
3.4 各组大鼠海马组织NE、5-HT含量比较 柴胡疏肝散可提高CUMS抑郁模型大鼠海马单胺类神经递质水平，见表3。
表3 各组大鼠海马组织NE、5-HT含量比较（±s） ng/L
表3 各组大鼠海马组织NE、5-HT含量比较（±s） ng/L
注：与正常组比较，1） P＜0.01；
与模型组比较，2） P＜0.05，3） P＜0.01；
与文拉法辛组比较，4） P＜0.05。
柴胡疏肝散出自《景岳全书》，是疏肝解郁的代表方剂，方中柴胡为君药，疏肝理气，畅达气机；
川芎、香附活血理气，辅助柴胡疏肝解郁；
陈皮、枳壳燥湿化痰，理气健脾；
白芍养血柔肝；
甘草调和药性。诸药相辅相成，共奏良好抗抑郁作用［3］。柴胡疏肝散治疗抑郁症临床疗效的Meta分析研究提示：单用柴胡疏肝散在改善抑郁症状和有效率方面明显优于抗抑郁药，且无严重不良反应［10］。文拉法辛作为临床上常见有效的抗抑郁药物，在国内外抗抑郁动物研究中均有明显作用［6］。根据《药理实验方法学》中大鼠的给药等效剂量相当于人的6.3倍，本实验采用文拉法辛临床常用剂量（75～225 mg/d）的剂量中值150 mg/d换算大鼠实验给药剂量，结果表明文拉法辛可改善抑郁模型大鼠抑郁状态。
本实验采用CUMS抑郁模型，其理论依据是通过模拟人类日常的不良应激因素，长期、慢性、不可预知的刺激诱发加速动物抑郁症的发展。CUMS抑郁模型是在国内外研究中广泛使用的模型，多采用孤养结合CUMS建立抑郁模型，具有高度有效性［11］。本实验结果表明：CUMS影响大鼠的日常活动，表现出精神倦怠、饮食减少、毛色暗淡、体质量减轻、易激惹，提示建模成功。经柴胡疏肝散治疗后，大鼠的状态明显改善，提示柴胡疏肝散具有抗抑郁作用。
PI3K/Akt信号通路作为近几年研究的重要通路之一，其在抗抑郁治疗和作用机制的研究逐渐被关注［12］。研究发现抑郁患者的PI3K和Akt酶活性降低，与抑郁障碍发生密切相关［13］。有研究发现CUMS抑郁模型小鼠海马组织PI3K和Akt的磷酸化水平下调，甘草酸可激活PI3K/Akt通路，上调相关蛋白活性，从而改善小鼠抑郁症状［14］。文拉法辛通过影响PI3K/Akt信号通路提高BDNF的表达，抑制海马组织神经元的凋亡，从而发挥抗抑郁作用［15］。有学者通过网络药理学对柴胡疏肝散抗抑郁作用的分子水平机制分析，发现其主要与PI3K/Akt信号通路有关［5］。本实验结果表明：柴胡疏肝散可逆转CUMS抑郁模型大鼠海马组织p-PI3K和p-Akt的抑制作用，上调PI3K和Akt的磷酸化水平，表明柴胡疏肝散通过激活PI3K/Akt通路发挥抗抑郁作用。
研究显示在抑郁症的发病和抗抑郁药物治疗机制中，NE、5-HT受体起着重要作用，抑郁症患者血清NE、5-HT明显低于正常人［16］。有研究发现百合逍遥散可上调抑郁模型大鼠海马组织的NE与5-HT含量，与氟西汀联用可增强抗抑郁疗效［17］。本实验结果表明：柴胡疏肝散可上调CUMS抑郁模型大鼠海马组织的NE、5-HT含量，与文拉法辛组在上调CUMS抑郁模型大鼠海马组织的NE、5-HT方面具有等效性。
综上，柴胡疏肝散可通过调控PI3K/Akt信号通路，改善CUMS抑郁模型大鼠的抑郁行为，以及提高海马组织NE、5-HT含量，充分证实了柴胡疏肝散对CUMS抑郁模型大鼠具有抗抑郁的治疗作用，为本方治疗抑郁症的临床应用提供了科学依据。
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