张萌 刘旭明 麦皓尘 曾志芬
中山大学孙逸仙纪念医院1全科医学科，2病理科（广州 510000）
胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一，其中位生存期仅6～8个月，5年生存率仅7%～9%[1]，严重威胁着人类的健康。研究[2-3]发现超过90%的胰腺癌患者存在 KRAS（kirsten rat sarcoma viral oncogene）突变，但相关的靶向药物研究进展缓慢，目前仅有一个针对KRAS G12C突变的小分子抑制剂处于临床试验阶段，且观察到其副作用较多[4]。溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）是胱氨酸-谷氨酸运载体，其通过介导胱氨酸摄取促进谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成，保护细胞免受氧化应激损伤，在维持细胞内外的氧化还原平衡中起重要作用[5]。已有研究[6]表 明KRAS突变肿瘤必须依靠SLC7A11摄取胱氨酸，由此推测KRAS突变的胰腺癌可能对SLC7A11抑制剂尤为敏感。柳氮磺吡啶是FDA批准的SLC7A11抑制剂[7]，临床上已应用于炎性肠病多年，副作用轻微可控。目前，KRAS测序越来越普及，但甚少有医院或生物公司开展SLC7A11的表达检测。本研究拟回顾性分析在中山大学孙逸仙纪念医院住院治疗的54例胰腺癌患者的临床资料，了解SLC7A11在KRAS突变胰腺癌中的阳性表达率，并探讨其与胰腺癌分化、淋巴结转移、疾病分期及预后的关系，这对于拟定SLC7A11治疗的病例筛选标准、寻找胰腺癌的潜在治疗靶点具有重要意义。
1.1 入选病例标准及研究分组在中山大学孙逸仙纪念医院病历系统检索2019年1月1日至2021年12月31日入住该院、手术病理确诊为胰腺癌、完善了KRAS基因测序且具备完整临床资料及后续随访条件的54例患者（伦理批号：SYSEC-KY-KS-2021-186）。其中基因检测提示KRAS突变27例、设为实验组；
无KRAS突变27例，设为对照组。排除标准：（1）同时合并其他肿瘤；
（2）手术前曾接受其他抗肿瘤治疗；
（3）无法收集完整的临床资料；
（4）无条件进行后续随访。
1.2 临床资料收集以下资料：（1）一般资料：性别、年龄、MR、CT、Pet-CT等影像学结果；
（2）病理结果：肿物大小、组织学分化、淋巴结转移数据。根据患者影像学资料和病理结果，评价胰腺癌分期标准（TNM分期【AJCC第八版】）[8]。（3）KRAS基因检测结果；
（4）分别在患者出院后6个月、1年、1.5年及2年电话随访，登记患者的生存状况。
1.3 SLC7A11检测
1.3.1 试剂兔抗xCT（SLC7A11，克隆号ab37185）多克隆抗体购于美国abcam公司，鼠抗ki67（MIB-1，克隆号ZM-0167）单克隆抗体、PV6000通用型免疫组化试剂盒（小鼠/兔聚合物法检测系统）、EDTA抗原修复液、封闭山羊血清购于北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3.2 检测方法胰腺癌组织标本经过中性福尔马林固定液固定、脱水、浸蜡、包埋制成目标组织蜡块，以4 μm厚度切片；
目标切片经过脱水、脱蜡、抗原修复液、封闭等处理，滴加一抗孵育过夜，滴加二抗，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片后阅片。
1.3.3 结果判读SLC7A11染色阳性呈黄色或棕黄色，主要位于细胞浆和细胞膜，40倍物镜下随机选取5个视野进行观察，根据肿瘤阳性率及染色强度进行综合评分，评分标准：阳性细胞数＜10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；
染色强度分为无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；
阳性细胞数与染色强度两项得分相乘结果去均值为综合评分，最后综合评分＜3分为阴性，≥3分为阳性；
以上由病理专业人员在双盲法下进行操作。
1.4 统计学方法本研究涉及的所有数据采用SPSS 26.0统计分析软件。计量资料数据用均值±标准差表示。SLC7A11的表达和临床病理参数之间的关系采用χ2检验分析。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。
2.1 SLC7A11表达情况在KRAS阳性实验组，SLC7A11阳性表达率为70.37%；
在KRAS阴性对照组，SLC7A11阳性表达率为25.93%。KRAS阳性实验组的SLC7A11阳性表达率显著高于阴性对照组，其差异具有统计学意义（P=0.002），见表1。
表1 KRAS阴性对照组及阳性实验组SLC7A11表达情况Tab.1 Expression of SLC7A11 in KRAS bright control group and positive experimental groups 例
2.2 胰腺癌患者临床病理特征和SLC7A11的表达情况研究SLC7A11的阳性表达与患者年龄、性别、疾病分期、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移及生存期各个因素的相关性，发现SLC7A11的阳性表达与年龄（P=1.000）、性别（P=0.747）、肿瘤大小（P=1.000）无关，与更晚的疾病分期（P＜0.001）、更差的组织学分级（P=0.003）、更多的淋巴结转移（P=0.038）、更短的生存期（P＜0.001）相关，其差异具有统计学意义。见表2。
表2 KRAS突变胰腺癌患者临床病理特征和SLC7A11的表达情况Tab.2 Clinical characteristics of patients in pancreatic cancer with KRAS mutation samples and expression of SLC7A11 例
2.3 胰腺癌病理组织SLC7A11的表达结果A、B、C、D示SLC7A11在胰腺癌组织中肿瘤细胞的细胞浆和细胞膜呈阳性表达；
E、F示SLC7A11在胰腺导管上皮和间质细胞呈阴性表达。见图1。
图1 胰腺癌病理组织SLC7A11的表达Fig.1 SLC7A11 expression in pathological tissues of pancreatic cancer
胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一，严重地威胁着人类的健康和生命。2019年美国因胰腺癌死亡人数达45 750例，成为美国第4大癌症死因[9]。2020年全球胰腺癌新发病例逾49万例、死亡病例逾46万例。预计到2030年，胰腺癌将成为美国第2大癌症死因[10]。在我国，特别是在某些大城市，胰腺癌的发病率已与西方国家持平，跃居全身恶性肿瘤第7位[11]。同时，胰腺癌起病隐匿，进展迅速，早诊困难，80%左右的胰腺癌患者在诊断时已达局部晚期或者远处转移，预后极差。近年来，针对多种恶性肿瘤的创新药物（包括细胞免疫治疗）取得了一系列令人鼓舞的成就，但在胰腺癌治疗中却罕见疗效[12]。目前包括VEGF抑制剂贝伐珠单抗和多激酶抑制剂苏尼替尼等在内的靶向治疗在胰腺癌中单药或联合吉西他滨均未能改善患者生存期，唯一在晚期胰腺癌治疗中有统计学意义的靶向药物厄洛替尼联合吉西他滨也只比单用吉西他滨组改善了不到2周的生存期[13]。因此，胰腺癌的治疗除了手术、化疗和放疗等常规手段外，亟需寻求新的治疗手段。
KRAS是人类最常见的致癌基因——RAS基因中最主要的成员，异常的KRAS蛋白对胰腺癌的生长和维持至关重要[2]。KRAS往往是肿瘤发生的驱动基因，研究人员发现，在小鼠中突变的KRAS也能保持肿瘤的生长及帮助癌前肿瘤转变成浸润性肿瘤，关闭KRAS后，肿瘤消失了并且没有复发的迹象[14]。研究[15]发现，突变活化的KRAS在胰腺癌中可明显促进转录因子Nrf2的表达，进而激活下游的SLC7A11。2020年，一个针对KRAS突变、可有效抑制SLC7A11活性的小分子抑制剂HG106，被证实可阻断SLC7A11/GSH代谢轴，从而抑制了肺腺癌的生长[16]。该研究证实，SLC7A11是突变KRAS的潜在协同致死基因，并提示抑制SLC7A11-GSH轴或可成为KRAS突变胰腺癌的新型治疗方案。本研究发现，在KRAS突变的胰腺癌患者中，70.37%存在SLC7A11阳性表达；
而在KRAS阴性的患者中，仅有25.93%存在SLC7A11阳性表达，两者的阳性率差异具有统计学意义（P=0.002），这提示在KRAS突变较未发生该突变的患者中，SLC7A11的阳性表达几率更高。
正常细胞通过消耗NADPH将胱氨酸还原为半胱氨酸来维持细胞内的氧化还原稳态，而细胞的恶性增殖会导致NADH/NAD+升高，使细胞内氧化还原失衡，导致氧化应激[17]。有研究[18]表明，胰腺癌细胞高度依赖SLC7A11介导的胱氨酸摄取，以获取半胱氨酸来维持细胞内的氧化还原稳态，而高表达的SLC7A11可通过维持细胞内高水平的GSH来抵消因细胞恶性增殖导致的氧化应激，在胰腺癌的恶性增殖中发挥了重要的作用[19]。本研究发现，在54例胰腺癌患者中，有48.15%的病例SLC7A11表达阳性，这与相关报道相符[20]。在年龄、性别、疾病分期、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移及生存期多个研究因素中，SLC7A11的阳性表达与疾病分期、组织学分级、淋巴结转移和生存期密切相关，和SLC7A11阴性表达差异具有统计学意义，这说明SLC7A11高表达患者具有更差的组织学分化和预后。
由于KRAS的作用范围广，且KRAS与RAS的其他两个家族成员NRAS、HRAS同源，如果某种药物能直接抑制KRAS，也就能抑制NRAS、HRAS的活性，推测这种药物毒副作用较大。柳氮磺吡啶（sulfasalazine，SSZ）为磺胺类抗菌药，临床上已广泛用于溃疡性结肠炎、类风湿性骨关节炎等疾病的治疗，观察副作用轻微可控。其作用机制主要是抑制NF-κB活性发挥抗炎作用，近年来还发现其可通过拮抗SLC7A11/xCT功能诱导癌细胞铁死亡[21-22]以及其他多种途径抑制肿瘤细胞的转移[23-24]。本研究提示，在发生KRAS突变的病例中，SLC7A11呈现更高的阳性表达率。因此，在检测到KRAS基因突变的患者，应积极完善SLC7A11的检测；
对于SLC7A11阳性表达的患者可尝试SLC7A11抑制剂柳氮磺吡啶，这有望成为胰腺癌患者治疗的新思路。
本研究存在的局限性：（1）入选病例数较少，其原因是基因检测开展时间不长、且费用昂贵、未纳入医保；
因此完成基因检测的病例数不多；
（2）未对其机制有深入研究。后续将继续纳入更多符合条件的病例、扩充样本量，并建立动物或体外模型进行相关机制探索。